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一,,酶免疫電泳技術(shù)的原理
抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中電泳時,,在堿性緩沖液的條件下,抗原帶負電,,向正極移動,。不同分子量或還不同電荷的抗原,在相同條件下,,移動距離不等,。這些在不同部位的抗原,再與相關(guān)抗體經(jīng)擴散形成免疫沉淀線,。酶免疫電泳技術(shù)中的抗原與抗體就是酶和它的相應(yīng)抗體球蛋白,。酶抗原與酶抗體形成的免疫復(fù)合物是用底物顯色的,由于酶反應(yīng)的高度靈敏性,,使酶免疫電泳技術(shù)成為一項靈敏度高的檢測技術(shù),,但僅局限于酶蛋白的分析鑒定。
二,,辣根過氧化物酶(HRP)免疫電泳技術(shù)的程序
1,, 器材與設(shè)備
電泳儀(包括電泳槽);溫箱,;載玻片(7.5cm×2.5cm);小玻棒(長4cm左右,,直徑約1.5mm);打孔器,;鋪有濕紗布的帶蓋搪瓷盒,。
2,, 材料與試劑
感染病毒的植物病葉,健株葉片作對照,;辣根過氧化物酶(精制)制備的兔抗酶抗體,;瓊脂糖;0.1mol/pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,;底物與供氫體混合液(H2O2和DAB-4HC1),。
3,實驗程序
(1)將小玻棒放在潔凈的載玻片中央,,然后將3ml溶化的瓊脂糖溶液(0.8g瓊脂糖/100ml巴比妥鈉鹽酸緩沖液)澆制其上,,待冷凝后,用針尖挑去玻棒,,中央出現(xiàn)一穴槽,。
(2)在穴槽一端的兩側(cè)近邊沿2mm處各打一小孔(直徑2-3mm),在一孔穴中加入健株葉片汁液,在另一孔穴加入感染病毒的植株葉片汁液,。
(3)加汁液的孔穴一端接負極,,電泳緩沖液仍是0.1mol/LpH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,電壓150V,,電泳1h,。
(4)在穴槽加入抗HRP兔血清,置于濕盒中,,在37℃溫箱中反應(yīng)3h左右或室溫過夜。
(5)在生理鹽水中浸洗3-4天,,每天換水3次,。
(6) 敷上干凈的濕濾紙,置于40℃烘箱內(nèi)烘干,。
(7)浸入底物顯色,,從沉淀弧的形狀,部位不同,,比較健,,病汁液所形成的沉淀線。
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