一,,酶免疫電泳技術的原理
抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中電泳時,在堿性緩沖液的條件下,,抗原帶負電,,向正極移動。不同分子量或還不同電荷的抗原,,在相同條件下,,移動距離不等。這些在不同部位的抗原,,再與相關抗體經擴散形成免疫沉淀線,。酶免疫電泳技術中的抗原與抗體就是酶和它的相應抗體球蛋白。酶抗原與酶抗體形成的免疫復合物是用底物顯色的,,由于酶反應的高度靈敏性,,使酶免疫電泳技術成為一項靈敏度高的檢測技術,但僅局限于酶蛋白的分析鑒定,。
二,,辣根過氧化物酶(HRP)免疫電泳技術的程序
1,, 器材與設備
電泳儀(包括電泳槽);溫箱,;載玻片(7.5cm×2.5cm);小玻棒(長4cm左右,,直徑約1.5mm);打孔器,;鋪有濕紗布的帶蓋搪瓷盒,。
2, 材料與試劑
感染病毒的植物病葉,,健株葉片作對照,;辣根過氧化物酶(精制)制備的兔抗酶抗體;瓊脂糖,;0.1mol/pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,;底物與供氫體混合液(H2O2和DAB-4HC1)。
3,,實驗程序
(1)將小玻棒放在潔凈的載玻片中央,,然后將3ml溶化的瓊脂糖溶液(0.8g瓊脂糖/100ml巴比妥鈉鹽酸緩沖液)澆制其上,待冷凝后,,用針尖挑去玻棒,,中央出現一穴槽。
(2)在穴槽一端的兩側近邊沿2mm處各打一小孔(直徑2-3mm),在一孔穴中加入健株葉片汁液,,在另一孔穴加入感染病毒的植株葉片汁液,。
(3)加汁液的孔穴一端接負極,電泳緩沖液仍是0.1mol/LpH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,,電壓150V,,電泳1h。
(4)在穴槽加入抗HRP兔血清,,置于濕盒中,,在37℃溫箱中反應3h左右或室溫過夜。
(5)在生理鹽水中浸洗3-4天,,每天換水3次,。
(6) 敷上干凈的濕濾紙,置于40℃烘箱內烘干,。
(7)浸入底物顯色,,從沉淀弧的形狀,部位不同,,比較健,,病汁液所形成的沉淀線。
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