●取材和固定: 處死動(dòng)物后立即切取組織塊,并快速投入固定液中,。
●脫水和透明:
80%酒精(min)
95%酒精Ⅰ(min)
95%酒精Ⅱ(min)
*Ⅰ(min)
*Ⅱ(min)
二甲苯Ⅰ,、Ⅱ(min)
<2mm
45-60
45-60
45-60
15-30
2-4mm
60-120
60-120
60-120
30
4-5mm
120-240
120-240
120-240
60
注意事項(xiàng):1.脫水應(yīng)*,否則材料不能透明,,影響石蠟的浸入,,致使難以切片。
2.在低濃度或純酒精中,,每級(jí)停留不宜太長(zhǎng),,否則易使組織變軟,,助長(zhǎng)材料的解體,。
3.在高濃度或純酒精中,每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長(zhǎng),,否則會(huì)使組織變脆,,影響切片。
4.如需過(guò)夜,,應(yīng)停留在70%酒精中,。
5.使用透明劑時(shí),要隨時(shí)蓋緊蓋子,,以免空氣中的水分進(jìn)入,。
●
浸蠟和包埋:
浸蠟:將透明的組織放入蠟杯(Ⅰ)→蠟杯(Ⅱ)→蠟杯(Ⅲ)。浸蠟時(shí)間視材料大小而定,,一般總的浸蠟時(shí)間為2-4小時(shí)左右,。
包埋:1. 組織浸入石蠟后,包埋前將組織移入包埋用石蠟杯內(nèi),。從恒溫箱取出置于三角架上,,其下點(diǎn)燃酒精燈,以保持石蠟的溶解狀態(tài),。
2.準(zhǔn)備好包埋框,,將包埋用的鑷子在酒精燈上加溫(防止鑷子粘蠟)后,左手持蠟杯,,右手把加溫的鑷子放在蠟口(直立狀)倒蠟時(shí)讓石蠟沿鑷子注入包埋框內(nèi),。
3.迅速鑷取組織塊放入包埋框石蠟內(nèi),切面朝下放正置入框底并輕輕壓平,,以保證不再有氣泡,。
4.待石蠟表面凝固前將標(biāo)簽貼于其上,需注意勿使標(biāo)簽與標(biāo)本混淆,,當(dāng)蠟塊冷至蠟面有透明蠟?zāi)r(shí),,浸入冷水中迅速使其冷卻,否則蠟內(nèi)常形成結(jié)晶。
5.蠟塊*硬固后除去銅框,,以保證蠟*凝固,,立即修切,準(zhǔn)備制成切片或儲(chǔ)藏備用,。
●切片制作:
注意事項(xiàng): 1.室溫過(guò)高時(shí),,可將修好的蠟塊放到冰箱中冷卻一定時(shí)間。在夏季時(shí)可用冰塊冷卻刀和組織塊,,減少刀與組織塊在過(guò)程中產(chǎn)生的熱時(shí),,使石蠟保持合適的硬度以利于切片。
2.切片經(jīng)30%的乙醇初展后,,再用載玻片撈起蠟帶放入展片儀水盒內(nèi)(一般水溫為45℃左右),。待蠟片帶中的組織展平后,即可進(jìn)行分片和撈片,。
3. 切片時(shí)要及時(shí)清潔刀口,、除去蠟屑,否則易引起破碎,。
●貼片:
待切片在恒溫水內(nèi)充分?jǐn)傞_(kāi)展平后,,將載玻片垂直插入水中以毛面輕靠切片,并用毛筆將切片一邊撥于玻片上,,隨即將玻片直立提起,。快,!
●
烘片與脫蠟:
石蠟切片在90度烘箱內(nèi)烘半小時(shí)
經(jīng)二甲苯Ⅰ,、Ⅱ脫蠟各5-10min,然后放入100%,、95%,、90%、80%,、70%等各級(jí)酒精溶液中各3-5min,,再放入蒸餾水中3min。
●染色
1.將蒸餾水洗滌后的切片移入Harris蘇木精液中5-10min,,使細(xì)胞核著色,。
2.用自來(lái)水洗去切片上殘余的染液。
3.將切片放入1%鹽酸乙醇液(鹽酸1份+70%乙醇100份)中褪色,,見(jiàn)切片變紅,,顏色較淺即可,約數(shù)秒至數(shù)十秒鐘,。
4.入1%氨水或自來(lái)水浸洗,,使之返藍(lán),。
5.在蒸餾水中浸片刻。
6.0.5%伊紅酒精溶液中染色2-5min,,使細(xì)胞質(zhì)著色,。
●脫水和透明::
切片依次入95%酒精(Ⅰ)→95%酒精(Ⅱ)→*(Ⅰ)→*(Ⅱ)
→1:1*、二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ),,各級(jí)中停留1-5min,。
●封藏:
將切片從二甲苯(Ⅱ)中取出,用紙或布擦去材料周圍的二甲苯,。在材料中央滴一小滴樹(shù)膠,,然后,用鑷子加蓋蓋玻片,。切片封好后,,放在切片托盤上待干燥,即可用于觀察,。