在蛋白質(zhì)純化過程中主要用到的膜分離技術(shù)多為超濾,。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜,，使溶液中分子量較小的溶質(zhì)透過薄膜，而大分子被截留于膜表面,。大多數(shù)超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結(jié)合在一起而組成的,。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機(jī)械強(qiáng)度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優(yōu)點(diǎn)是：操作條件溫和,，無相變化,，對生物活性物質(zhì)沒有破壞。

超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐,、泵,、超濾器、透過液收集罐組成,，料液經(jīng)泵打入超濾器，水及低分子量物質(zhì)排出超濾器外,，被濃縮的料液在料液貯罐,、泵、及超濾器中循環(huán),。當(dāng)料液濃縮至一定的倍數(shù)后即可作為進(jìn)一步處理的濃縮料液,。

超濾應(yīng)用于蛋白質(zhì)類物質(zhì)的濃縮和脫鹽過程中時應(yīng)注意以下問題：*，在超濾循環(huán)過程中,，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用,，料液的溫度會逐漸升高，會造成蛋白質(zhì)分子的損失,。因此,，料液貯罐應(yīng)加冷卻系統(tǒng)，并安裝自動測溫及控制系統(tǒng),。第二,，某些酶的輔助因子散失為問題：一些酶含有輔助因子，其分子量小,，超濾時易從透過液中排除掉,，因而在超濾前或超濾后要添加一定濃度的的輔助因子。

還可將超濾與親和層析相結(jié)合以提高分離純度,。其工作原理是：當(dāng)溶液中欲被分離的蛋白質(zhì)不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時,，如果在膜的一側(cè)結(jié)合著親和配基，該蛋白質(zhì)就會與配基結(jié)合因而結(jié)聚在膜的這一側(cè),。不與配基結(jié)合的其他物質(zhì)就將穿過孔而被帶走,。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質(zhì)洗脫下來，洗脫液用于進(jìn)一步的分離純化,。

4.泡沫分離

原理：將氣體通入含多種組分的溶液中,，由于這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面,，某些組分將形成泡沫,，泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生物學(xué)特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同,。這樣,，溶液中的組分舅得以分離。

蛋白質(zhì)較易吸附與氣液界面,，這有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,。泡沫分離過程是：蛋白質(zhì)從主體溶液中擴(kuò)散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的,；分子發(fā)生重排,，一般認(rèn)為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜,，另一種是濃膜,，可能會發(fā)生由多個分子聚集在一起的現(xiàn)象。在氣液界面形成的蛋白質(zhì)膜可以是單層的也可以是多層的,。膜的類型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質(zhì)的特性,、結(jié)構(gòu)和濃度。

泡沫分離的目的,，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質(zhì)的濃度/zui初溶液中蛋白質(zhì)濃度）,，另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質(zhì)的提取率/zui初的蛋白質(zhì)質(zhì)量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數(shù)zui大,。

二,、抽提 沉淀

1.        鹽析

常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大,、價格便宜,。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的能力很強(qiáng)，其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來,。對酶沒有破壞作用,。

pH的控制：應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個方面考慮，在酶等電點(diǎn)時其溶解度zui小易沉淀,，但有些酶再等電點(diǎn)時穩(wěn)定性較差,，因此要選擇*pH值.一般要求在酶zui穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮zui適宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦確定*pH值后,，在添加硫酸銨之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的pH值,，要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時要注意攪拌,，并注意硫酸銨的加入速度,，一般是由少到多，緩慢加入,，硫酸銨盡可能磨成細(xì)粉,。

溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好,，可在常溫下進(jìn)行鹽析操作，而對于大多數(shù)酶,，盡可能在低溫下操作,。

酶液的凈置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時間,，使酶蛋白*沉淀下來,，酶靜置后，就不要再加以攪拌,。

2．有機(jī)溶劑沉淀

有機(jī)溶劑選擇：可用于酶蛋白沉淀的有機(jī)溶劑包括醇類物質(zhì)等,，如甲醇、乙醇,、異丙醇,。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質(zhì)的變性,，酶蛋白在其中的溶解度也較低。

有機(jī)溶劑沉淀操作：有機(jī)溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性,，當(dāng)溫度較高時變性蛋白質(zhì)分子就會變成*失活,。因此用有機(jī)溶劑處理時在0℃以下進(jìn)行。用有機(jī)溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過久,，要盡快加水溶解,。

3.聚合物絮凝劑沉淀     聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇,，與酶分子爭奪水分子,，具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點(diǎn)是在水溶液中,，其濃度可達(dá)到50%,，濃度為6%-12%的蛋白質(zhì)大都可以沉淀下來。這種試劑不需要低溫操作,，而且對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定還有一定的保護(hù)作用,。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除,。

4．用金屬離子和絡(luò)合物沉淀

酶和其他蛋白質(zhì)都會形成金屬鹽,，其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點(diǎn)是酶與金屬離子相互作用后,，可逆變化較差,，尤其是用巰基衍生物，它結(jié)合的]金屬離子會催化酶變性而失活,。

5．用特殊試劑沉淀法

用鏈霉素可選擇性去除核酸,，從而使胞內(nèi)酶沉淀出來,。鏈霉素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質(zhì)）對于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活,。