在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中主要用到的膜分離技術(shù)多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過(guò)孔徑非常小的濾膜,，使溶液中分子量較小的溶質(zhì)透過(guò)薄膜,，而大分子被截留于膜表面。大多數(shù)超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結(jié)合在一起而組成的,。功能膜決定了膜的孔徑,，而支撐膜提供機(jī)械強(qiáng)度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優(yōu)點(diǎn)是：操作條件溫和,，無(wú)相變化,，對(duì)生物活性物質(zhì)沒(méi)有破壞。

超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐,、泵,、超濾器、透過(guò)液收集罐組成,，料液經(jīng)泵打入超濾器,，水及低分子量物質(zhì)排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐,、泵,、及超濾器中循環(huán)。當(dāng)料液濃縮至一定的倍數(shù)后即可作為進(jìn)一步處理的濃縮料液,。

超濾應(yīng)用于蛋白質(zhì)類物質(zhì)的濃縮和脫鹽過(guò)程中時(shí)應(yīng)注意以下問(wèn)題：*,，在超濾循環(huán)過(guò)程中，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用,，料液的溫度會(huì)逐漸升高,，會(huì)造成蛋白質(zhì)分子的損失。因此,，料液貯罐應(yīng)加冷卻系統(tǒng),，并安裝自動(dòng)測(cè)溫及控制系統(tǒng)。第二,，某些酶的輔助因子散失為問(wèn)題：一些酶含有輔助因子,，其分子量小,，超濾時(shí)易從透過(guò)液中排除掉，因而在超濾前或超濾后要添加一定濃度的的輔助因子,。

還可將超濾與親和層析相結(jié)合以提高分離純度,。其工作原理是：當(dāng)溶液中欲被分離的蛋白質(zhì)不受阻礙地通過(guò)超濾膜的孔隙時(shí)，如果在膜的一側(cè)結(jié)合著親和配基,，該蛋白質(zhì)就會(huì)與配基結(jié)合因而結(jié)聚在膜的這一側(cè),。不與配基結(jié)合的其他物質(zhì)就將穿過(guò)孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質(zhì)洗脫下來(lái),，洗脫液用于進(jìn)一步的分離純化,。

4.泡沫分離

原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由于這些組分的表面活性由差異,，因此在溶液的表面,，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生物學(xué)特性,。泡沫中含有更多的表面活性成分,，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣,，溶液中的組分舅得以分離,。

蛋白質(zhì)較易吸附與氣液界面，這有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,。泡沫分離過(guò)程是：蛋白質(zhì)從主體溶液中擴(kuò)散到氣液界面,，該過(guò)程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發(fā)生重排,，一般認(rèn)為在空氣-水界面會(huì)形成兩種類型的膜,，一種是稀膜，另一種是濃膜,，可能會(huì)發(fā)生由多個(gè)分子聚集在一起的現(xiàn)象,。在氣液界面形成的蛋白質(zhì)膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質(zhì)的特性,、結(jié)構(gòu)和濃度,。

泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質(zhì)的濃度/zui初溶液中蛋白質(zhì)濃度）,，另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質(zhì)的提取率/zui初的蛋白質(zhì)質(zhì)量）,，或使多組分混合物中某一組分的分配系數(shù)zui大。

二,、抽提 沉淀

1.        鹽析

常用的鹽析劑是硫酸銨,，其溶解度大、價(jià)格便宜。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的能力很強(qiáng),，其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái),。對(duì)酶沒(méi)有破壞作用,。

pH的控制：應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個(gè)方面考慮,，在酶等電點(diǎn)時(shí)其溶解度zui小易沉淀，但有些酶再等電點(diǎn)時(shí)穩(wěn)定性較差,，因此要選擇*pH值.一般要求在酶zui穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮zui適宜酶沉淀的pH值,。在操作中一旦確定*pH值后，在添加硫酸銨之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的pH值,，要盡量避免溶液pH值的波動(dòng)以免破壞酶的穩(wěn)定性,。在添加硫酸銨時(shí)要注意攪拌，并注意硫酸銨的加入速度,，一般是由少到多,，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細(xì)粉,。

溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好,，可在常溫下進(jìn)行鹽析操作，而對(duì)于大多數(shù)酶,，盡可能在低溫下操作,。

酶液的凈置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時(shí)間,，使酶蛋白*沉淀下來(lái),，酶靜置后，就不要再加以攪拌,。

2．有機(jī)溶劑沉淀

有機(jī)溶劑選擇：可用于酶蛋白沉淀的有機(jī)溶劑包括醇類物質(zhì)等,，如甲醇、乙醇,、異丙醇,。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質(zhì)的變性,，酶蛋白在其中的溶解度也較低,。

有機(jī)溶劑沉淀操作：有機(jī)溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性，當(dāng)溫度較高時(shí)變性蛋白質(zhì)分子就會(huì)變成*失活,。因此用有機(jī)溶劑處理時(shí)在0℃以下進(jìn)行,。用有機(jī)溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過(guò)久，要盡快加水溶解,。

3.聚合物絮凝劑沉淀     聚合物絮凝劑,，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭(zhēng)奪水分子，具有脫水作用使酶沉淀,。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點(diǎn)是在水溶液中,，其濃度可達(dá)到50%，濃度為6%-12%的蛋白質(zhì)大都可以沉淀下來(lái),。這種試劑不需要低溫操作,，而且對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定還有一定的保護(hù)作用。聚乙二醇不會(huì)被吸附,，故在離子交換吸附前不必去除,。

4．用金屬離子和絡(luò)合物沉淀

酶和其他蛋白質(zhì)都會(huì)形成金屬鹽，其溶解度較低,。用金屬離子沉淀的缺點(diǎn)是酶與金屬離子相互作用后,，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物,，它結(jié)合的]金屬離子會(huì)催化酶變性而失活,。

5．用特殊試劑沉淀法

用鏈霉素可選擇性去除核酸，從而使胞內(nèi)酶沉淀出來(lái),。鏈霉素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質(zhì)）對(duì)于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子還要好,，酶不易失活。