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中級(jí)會(huì)員 | 第16年

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ELISA實(shí)驗(yàn)用什么酶標(biāo)記抗原抗體

時(shí)間:2024/6/4閱讀:933
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在ELISA中,用酶標(biāo)記的抗體或抗原統(tǒng)稱為結(jié)合物,,此為進(jìn)行ELISA檢測(cè)的關(guān)鍵試劑,。常規(guī)使用ELISA法的主要問(wèn)題是能夠簡(jiǎn)便地制備酶結(jié)合物,而此種制備好的酶結(jié)合物要求穩(wěn)定,,具有很高的酶活性,,抗原或抗體的特異性,產(chǎn)量高及成本低,。

    那么用什么樣的酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體呢,?

    1.酶制品的純度及活力高,催化效力也高,,放大倍數(shù)大(即一個(gè)酶分子能催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng)的酶),。

    2.酶及制備好的酶結(jié)合物在檢測(cè)或貯存中能保持穩(wěn)定。

    3.酶制劑易得,、價(jià)廉.

    4.既要適用于標(biāo)記抗原,,又適用于標(biāo)記抗體,標(biāo)記后不影響抗原或抗體的免疫學(xué)特性,,也不降低酶的活性,。

    5.酶的反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定,檢測(cè)時(shí)簡(jiǎn)便,、快速,。在定量測(cè)定中產(chǎn)物必須是可溶性的。

    6.要有安全,、價(jià)廉,、易得的底物,。

    符合上述條件的酶有:堿性磷酸酶,一般用分子量為5×105(Alkaline Phospatase,簡(jiǎn)稱AP),,辣根過(guò)氧化物酶(Horse Radish Peroxidase,簡(jiǎn)稱HRP,分子量為4×104),另外尚有葡萄糖氧化酶,,β-半乳糖甙酶,糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等,。其中以前兩種(AP和HRP)zui為常用,。

    AP活力高,制備好的酶結(jié)合物可加NaN3防腐,,但此種酶不易獲得,,因其是從小牛腸粘膜中或大腸桿菌中提取,而且價(jià)格比較昂貴,。因此,,目前國(guó)內(nèi)外大多使用HRP。HRP活性也高,,價(jià)格較便宜,。但制得酶結(jié)合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性,,但可作低溫保存或加60%緩沖甘油等量混合后少量分裝,,保存冰箱,一般可用1-2年,。

   結(jié)合:用什么樣的方法將HRP與抗體球蛋白結(jié)合起來(lái)呢,?當(dāng)然不能用強(qiáng)烈的方法,因?yàn)閺?qiáng)烈的方法會(huì)使酶和抗體失去活性,。故只能用溫和的方法把酶和抗體結(jié)合起來(lái),。因此,必須使用結(jié)合劑,。理想的結(jié)合劑應(yīng)具備下列條件:

1.不影響酶及抗體活性,;

2.不產(chǎn)生干擾物質(zhì);

3.抗體和酶結(jié)合后應(yīng)有較高的產(chǎn)量,;

4.不出現(xiàn)非特異性反應(yīng),;

5.結(jié)合程序簡(jiǎn)便;

6.來(lái)源易,、價(jià)廉,。

目前常用的有戊二醛和過(guò)碘酸鈉二種。由于對(duì)所使用結(jié)合劑的針對(duì)性,,因此標(biāo)記的方法也有戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鈉氧化法兩類,。


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