日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司

流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理

時間:2010-1-18 閱讀:3017
分享:

流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理

流式細(xì)胞術(shù)概述

     流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù),、流體力學(xué),、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體, 同時具有分析和分選細(xì)胞功能,。它不僅可測量細(xì)胞大小,、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA,、RNA含量等,可對群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析, 在短時間內(nèi)檢測分析大量細(xì)胞,并收集,、儲存和處理數(shù)據(jù),進(jìn)行多參數(shù)定量分析; 能夠分類收集(分選)某一亞群細(xì)胞,分選純度>95%。在血液學(xué),、免疫學(xué),、腫瘤學(xué)、藥物學(xué),、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用,。
國內(nèi)使用的流式細(xì)胞儀主要由美國的兩個廠家生產(chǎn):BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(簡稱B-D公司)。流式細(xì)胞儀主要有兩型:臨床型(又稱小型機(jī),、臺式機(jī))和綜合型(又稱大型機(jī),、分析型)。BECKMAN-COULTER公司產(chǎn)品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D公司產(chǎn)品為FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型,,除具備檢測分析功能外,還具有細(xì)胞分選功能,多用于科學(xué)研究,。

.流式細(xì)胞儀主要技術(shù)指標(biāo)

1.流式細(xì)胞儀的分析速度:
一般流式細(xì)胞儀每秒檢測1000~ 5000個細(xì)胞,大型機(jī)可達(dá)每秒上萬個細(xì)胞。
2.流式細(xì)胞儀的熒光檢測靈敏度:一般能測出單個細(xì)胞上<600個熒光分子,兩個細(xì)胞間的熒光差>5%即可區(qū)分,。
3.前向角散射(FSC)光檢測靈敏度:前向角散射(FSC)反映被測細(xì)胞的大小,一般流式細(xì)胞儀能夠測量到0.2μm~0.5μm,。
4.流式細(xì)胞儀的分辨率:通常用變異系數(shù)CV值來表示,,一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到<2.0%,這也是測量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時要求必須達(dá)到的,。
   5.流式細(xì)胞儀的分選速度:一般流式細(xì)胞儀分選速度>1000個/秒,,分選細(xì)胞純度可達(dá)99%以上。

.流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理    流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀主要由以下五部分構(gòu)成:①流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)②激光光源及光束形成系統(tǒng)③光學(xué)系統(tǒng)④信號檢測與存儲,、顯示,、分析系統(tǒng)⑤細(xì)胞分選系統(tǒng)。
流動室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式細(xì)胞儀的核心部件,,流動室由石英玻璃制成,,單細(xì)胞懸液在細(xì)胞流動室里被鞘流液包繞通過流動室內(nèi)的一定孔徑的孔,檢測區(qū)在該孔的中心,細(xì)胞在此與激光垂直相交,,在鞘流液約束下細(xì)胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū),。流動室里的鞘液流是一種穩(wěn)定流動,控制鞘液流的裝置是在流體力學(xué)理論的指導(dǎo)下由一系列壓力系統(tǒng),、壓力感受器組成,只要調(diào)整好鞘液壓力和標(biāo)本管壓力, 鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向,,能夠保證每個細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時間相等,,從而使激光激發(fā)的熒光信息準(zhǔn)確無誤。見圖12.1流動室示意圖,。流動室孔徑有60μm,、100μm、150μm ,、250μm等多種,,供研究者選擇。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動室,。
圖12.1流動室示意圖(采自Coulter Training Guide)

 激光光源及光束形成系統(tǒng)

    流式細(xì)胞儀可配備一根或多根激光管,,常用的激光管是氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波長488ηm,此外可配備氦氖離子氣體激光管(波長633ηm)和/或紫外激光管,。

流式細(xì)胞儀的主要測定信號熒光是由激發(fā)光激發(fā)的,,熒光信號的強(qiáng)弱與激發(fā)光的強(qiáng)度和照射時間相關(guān),激光是一種相干光源,它能提供單波長,、高強(qiáng)度,、高穩(wěn)定性的光照,正是能達(dá)到這一要求的理想的激發(fā)光光源。
    在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡,,將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束(22μm×66μm),,在這種橢圓形激光光斑內(nèi)激光能量成正態(tài)分布,使通過激光檢測區(qū)的細(xì)胞受照強(qiáng)度一致,。

光學(xué)系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由若干組透鏡,、小孔、濾光片組成,,大致可分為流動室前和流動室后兩組,。流動室前的光學(xué)系統(tǒng)由透鏡和小孔組成,透鏡和小孔(一般為2片透鏡,、1個小孔)的主要作用是將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束,,使激光能量成正態(tài)分布,使通過激光檢測區(qū)的細(xì)胞受照強(qiáng)度一致,,zui大限度的減少雜散光的干擾,;流動室后的光學(xué)系統(tǒng)主要由多組濾光片組成,濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管,。濾光片主要有三類:長通濾片(LP)--只允許特定波長以上的光線通過,,短通濾片(SP)-- 只允許特定波長以下的光線通過,帶通濾片(BP)-- 只允許特定波長的光線通過,,不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管(PMT),如接收綠色熒光(FITC)的PMT前面配置的濾光片是LP550和BP525, 接收色橙紅色熒光(PE)的PMT前面配置的濾光片是LP600和BP575, 接收紅色熒光(CY5)的PMT前面配置的濾光片是LP650和BP675,。見圖12.2光學(xué)系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)示意圖。

信號檢測系統(tǒng)

    當(dāng)測定標(biāo)本在鞘流液約束下細(xì)胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)時產(chǎn)生散射光和熒光信號,散射光分為前向角散射(Forward Scatter, FS)和側(cè)向角散射或900散射(Side Scatter, SS),散射光是細(xì)胞的物理參數(shù)與細(xì)胞樣本的制備(如染色)無關(guān);熒光信號也有兩種,一種是細(xì)胞自發(fā)熒光它一般很微弱,一種是細(xì)胞樣本經(jīng)標(biāo)有特異熒光素的單克隆抗體染色后經(jīng)激光激發(fā)發(fā)出的熒光,,它是我們要測定的熒光,熒光信號較強(qiáng),這兩種熒光信號的同時存在是我們測定時需要設(shè)定陰性對照的理由,以便從測出的熒光信號中減去細(xì)胞自發(fā)熒光和抗體非特異結(jié)合產(chǎn)生的熒光,。

前向角散射(FS)反映被測細(xì)胞的大小,它由正對著流動室的光電二極管裝置接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺粋?cè)向角散射或900散射(SS)反映被測細(xì)胞的細(xì)胞膜,、細(xì)胞質(zhì),、核膜的折射率和細(xì)胞內(nèi)顆粒的性狀, 它由一個光電倍增管(PMT) 接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?這些電信號存儲在流式細(xì)胞儀的計算機(jī)硬盤或軟盤內(nèi)。

流式細(xì)胞儀測定常用的熒光染料有多種,他們分子結(jié)構(gòu)不同,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異,選擇熒光染料時必須依據(jù)流式細(xì)胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長(如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488ηm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長633ηm),。488ηm激光光源常用的熒光染料有FITC(異硫氰酸熒光素),、PE(藻紅蛋白)、PI(碘化丙啶),、CY5(化青素),、preCP(葉綠素蛋白)、ECD(藻紅蛋白-得克薩斯紅)等,。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是:
             激發(fā)光波長(ηm)       發(fā)射光峰值(ηm)
FITC            488                      525(綠)
PE              488                      575(橙紅)  
PI              488                      630(橙紅)
ECD             488                      610(紅)
CY5             488                      675(深紅)
PreCP           488                      675(深紅)
    各種熒光信號由各自的光電倍增管(PMT) 接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡蟠鎯υ诹魇郊?xì)胞儀的計算機(jī)硬盤或軟盤內(nèi).見圖12.2光學(xué)系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)示意圖,。

信號存儲、顯示,、分析系統(tǒng)


(一) 信號存儲
存儲在流式細(xì)胞儀的計算機(jī)硬盤或軟盤內(nèi)的數(shù)據(jù)一般是以List mode(列表排隊)方式存入的,采用List mode方式有兩大優(yōu)點(diǎn):①節(jié)約內(nèi)存和磁盤空間②易于加工處理分析,。
(二)信號顯示和分析
由于List mode方式數(shù)據(jù)缺乏直觀性,,數(shù)據(jù)的顯示和分析一般采用一維直
方圖(圖12.3)、二維點(diǎn)陣圖(圖12.4,12.5),、等高線圖(圖12.8)和密度圖(圖12.7),。
     1.單參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細(xì)胞的每一個單參數(shù)測量數(shù)據(jù)用直方圖來顯 示,圖中橫坐標(biāo)表示散射光或熒光信號相對強(qiáng)度值,,其單位是道數(shù),,可以是線性的,也可以是對數(shù)的,;縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù),。見圖12.3一維直方圖,圖中橫坐標(biāo)是FITC熒光信號相對強(qiáng)度值(對數(shù)),,縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù);圖中已根據(jù)陰性對照設(shè)定適當(dāng)?shù)?ldquo;門”(直線門),,儀器的計算機(jī)就會給出測定值(包括陽性細(xì)胞%和平均熒光強(qiáng)度)。

2.雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細(xì)胞的雙參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系用一維直方圖,、二維點(diǎn)陣圖,、等高線圖和密度圖顯示和分析。如圖12.4二維點(diǎn)陣圖,,是正常人外周血白細(xì)胞的前向散射光(FS)和側(cè)向散射光(SS)組成的點(diǎn)陣圖,,橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均是線性的,圖中淋巴細(xì)胞,、單核細(xì)胞,、粒細(xì)胞很明顯地分為3群,可以很容易地圈“門”( Bitmap,,無定型門),,分析各亞群細(xì)胞的數(shù)據(jù);圖12.6假三維地形圖(X軸: SSC ,Y軸:FSC Z軸:細(xì)胞數(shù))更清楚地表明這一點(diǎn)。圖12.5二維點(diǎn)陣圖是細(xì)胞的兩種熒光(FITC和RD1)雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示,,橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均是對數(shù)的,,橫坐標(biāo)代表FITC,,縱坐標(biāo)代表PE,,圖中已設(shè)定適當(dāng)?shù)?ldquo;門”(十字門),十字門的D1,、D2,、D3、D4門分別代表PE單陽性細(xì)胞,、PE和FITC雙陽性細(xì)胞 ,、陰性細(xì)胞、FITC單陽性細(xì)胞,。儀器的計算機(jī)就會給出兩種熒光測定值(包括陰性細(xì)胞%,、兩種熒光各自的陽性細(xì)胞%,、兩種熒光的雙陽性細(xì)胞%、各群細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度),。 圖12.7和圖12.8分別是測定細(xì)胞的兩種熒光雙參數(shù)數(shù)據(jù)的密度圖和等高線圖,,橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別代表一種熒光參數(shù),同理只要設(shè)定十字門就可得到兩種熒光的各種測定值,,密度圖和等高線圖較點(diǎn)陣圖更直觀,。
   3.三參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細(xì)胞的三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系每兩個數(shù)據(jù)組成一對(三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量每兩個數(shù)據(jù)可組成6對數(shù)據(jù))用一維直方圖、二維點(diǎn)陣圖,、等高線圖和密度圖顯示和分析,。三個熒光數(shù)據(jù)關(guān)系用分光圖(prism)表示,分光圖可直接給出8個數(shù)據(jù)(如用ABC代表3種熒光,,可有A+B+C+,、A+B+C- 、A+B-C-,、 A-B+C+,、 A-B+C-、 A-B-C+,、 A+B-C+ ,、A-B-C-)。見圖12.9 prism,,圖12.9為人外周血淋巴細(xì)胞亞群測定結(jié)果的分光圖,,圖中給出CD3、CD4,、CD8組合的各種結(jié)果,,如T輔助細(xì)胞(CD3+CD4+CD8-)為42.0%,如T抑制細(xì)胞(CD3+CD4+CD8-)為17.4%。

圖12.5兩種熒光的二維點(diǎn)陣圖(采自Coulter Operaters Guide) 
   圖12.7. 雙參數(shù)數(shù)據(jù)的密度圖(采自Coulter Operaters Guide)      
   圖12.6假三維地形圖和二維點(diǎn)陣圖(采自Coulter Operaters Guide)
   圖12.8雙參數(shù)數(shù)據(jù)的等高線圖(采自Coulter Operaters Guide)
   圖12.9 分光圖(prism)

細(xì)胞分選系統(tǒng)

 如在細(xì)胞流動室上裝有超聲壓電晶體,通電后超聲壓電晶體發(fā)生高頻震動,,可帶動細(xì)胞流動室高頻震動,使細(xì)胞流動室噴咀流出的液流束斷成一連串均勻的液滴, 每秒鐘形成液滴上萬個,。每個液滴中包含著一個樣品細(xì)胞,液滴中的細(xì)胞在形成液滴前已被測量,如符合預(yù)定要求則可被充電,在通過偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場時向左或向右偏轉(zhuǎn)被收集在容器中,不含細(xì)胞液滴或細(xì)胞不符合預(yù)定要求液滴不被充電亦不發(fā)生偏轉(zhuǎn)進(jìn)入中間廢液收集器中,從而實(shí)現(xiàn)了分選。分選的詳細(xì)原理和操作請有興趣者參考有關(guān)文獻(xiàn),。


 

會員登錄

×

請輸入賬號

請輸入密碼

=

請輸驗(yàn)證碼

收藏該商鋪

X
該信息已收藏,!
標(biāo)簽:
保存成功

(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我們將在第一時間回復(fù)您~
撥打電話 產(chǎn)品分類
在線留言