一篇看懂液相色譜柱的分類,、選擇及維護(hù)!
1.硅膠基質(zhì)
1.1反相色譜柱：反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相,。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng),，通常為水，緩沖液與甲醇,，已腈等混合物,。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)組合最先被沖出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留,。常用的反相填料有C18(ODS),、C8(MOS)、C4(B),、C6H5(Phenyl)等,。
1.2正相色譜：正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)，以及其他具有極性官能團(tuán),，如胺基團(tuán)(NH2,APS)和氰基團(tuán)(CN,，CPS)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他團(tuán)的極性較強(qiáng),，因此,，分離的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性大小，即極性強(qiáng)弱的組份最先被沖洗出色譜柱,。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低,，如：正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(MethyleneChloride)等,。
1.3離子交換色譜柱：以磺化交聯(lián)強(qiáng)陰/陽離子鍵合硅膠色譜柱，常用規(guī)格：強(qiáng)陰離子色譜柱(SAX),，強(qiáng)陽離子交換色譜柱(SCX)
2.聚合物基質(zhì):聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,，其主要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1～14均可使用。相對(duì)與硅膠基質(zhì)的C18填料,，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性,；大孔的聚合物填料對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效?，F(xiàn)在的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料,，色譜柱柱效較低。
所有聚合物基質(zhì)在流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)都會(huì)出現(xiàn)膨脹或收縮,。用于HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料,，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質(zhì)中,，因?yàn)樾》肿釉诰酆衔锘|(zhì)中的傳質(zhì)比在陶瓷性基質(zhì)中慢,，所以造成小分子在這種基質(zhì)中柱效低。對(duì)于大分子像蛋白質(zhì)或合成的高聚物,，聚合物基質(zhì)的效能比得上陶瓷性基質(zhì),。因此，聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì),。
3.其他無機(jī)填料:其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化,。
由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途,。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料,。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ),，不再需其它的表面改性,，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體,，又由于HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解,，這類柱可在任何PH與溫度下使用。
氧化鋁也可用于HPLC,，氧化鋁微粒剛性強(qiáng),，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可在PH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用,。
但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng),，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用,，新型氧化鋯填料也可用于HPLC,，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱,，應(yīng)用PH范圍1～14，溫度可達(dá)100℃,。由于氧化鋯填料幾年才開始研究,，加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行中,。
二.色譜柱的選擇
液相色譜儀基質(zhì)的選擇大致遵循以下法則,，硅膠基質(zhì)的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物,，聚合物填料用于大分子量的被分析物質(zhì),，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。
色譜柱在使用前,，最好進(jìn)行柱的性能測試,，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考,。在做柱性能測試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是最佳條件),，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性,。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品,、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同,。
三.色譜柱的維護(hù)
1.色譜柱的平衡
反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的,。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請(qǐng)一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶,。每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來平衡色譜柱,，您就會(huì)在處理問題方面獲得最大的"補(bǔ)償"，
2.色譜柱的再生,長期使用的色譜柱,，往往柱效會(huì)下降(柱子的理論塔板數(shù)減低),。可以對(duì)色譜柱進(jìn)行再生,，在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生,。
建議用來沖洗柱子的溶劑體積
3.色譜柱的維護(hù)
a.使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度)
b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍
c.避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化
d.流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理
e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相,，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈,，并保存于甲醇或乙腈中
f.氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意,，柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑,，以避免腐蝕。
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