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生物制品中內(nèi)毒素檢測方法及去除工藝

閱讀：614 發(fā)布時間：2025-2-5

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種脂多糖成分，是一種常見的病原體,，細(xì)菌在生長,、分裂或死亡過程中都會向環(huán)境中釋放內(nèi)毒素。內(nèi)毒素是兩親性分子,，由親水性多糖部分和共價結(jié)合的疏水性脂質(zhì)成分（稱為脂質(zhì)A）組成,；多糖部分可分為兩個結(jié)構(gòu)域，核心多糖和O特異性抗原多糖,，脂質(zhì)A成分已被確定為內(nèi)毒素活性的LPS 成分,。

生物制品在生產(chǎn)過程中常常會受到細(xì)菌內(nèi)毒素的污染，從而對生物制品造成污染,，其存在會嚴(yán)重影響生物制品的質(zhì)量和安全性,，進(jìn)而對人體造成嚴(yán)重危害。內(nèi)毒素通過引發(fā)炎癥和激活免疫系統(tǒng),，導(dǎo)致多種生物學(xué)反應(yīng),，旨在清除入侵的致病菌，但是過度的內(nèi)毒素暴露或免疫反應(yīng)失控可能導(dǎo)致嚴(yán)重病理生理反應(yīng),，如發(fā)熱,、心動過速、呼吸急促,、低血壓,、彌散性血管內(nèi)凝血和多器官衰竭等,。因此,，如何有效地去除生物制品中的內(nèi)毒素成為生物制品安全性與質(zhì)量保障的關(guān)鍵。內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)特征就是去除細(xì)菌內(nèi)毒素的基礎(chǔ),，目前已形成多種內(nèi)毒素去除工藝,，包括超濾法、活性炭吸附法,、萃取法,、荷電微孔濾膜法、離子交換色譜法和親和色譜法等,。

內(nèi)毒素作用分子機(jī)制：

細(xì)菌脂多糖是革蘭氏陰性菌的一種膜糖脂,，是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞促炎反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑，脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）可與細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）直接相互作用形成復(fù)合物,。CD14是一種單核細(xì)胞分化抗原,，被確定為 LPS 的主要受體，與LPS 具有高親和力,。當(dāng)血液中有 LPS 時,，LPS 與LBP 結(jié)合，然后結(jié)合細(xì)胞表面蛋白 CD14,，形成 LBP-LPS-CD14 復(fù)合體,。CD14 可以將 LPS 轉(zhuǎn)運(yùn)到 Toll樣受體 4（TLR4）及髓樣分化蛋白 2（MD2）蛋白復(fù)合體，MD2 為 TLR4 的輔助蛋白,，可以幫助 TLR4 識別 LPS,，TLR4 屬于跨膜蛋白，LPS 與 TLR4-MD2 結(jié)合后,，TLR4 被激活,，使得膜內(nèi)基團(tuán)的構(gòu)象發(fā)生變化，將信號轉(zhuǎn)到免疫細(xì)胞內(nèi)部,，激活髓樣分化因子 88（MyD88）,、IL-1R 相關(guān)蛋白激酶（IRAK）和腫瘤壞死因子受體活化因子6等信號分子，從而引發(fā) LPS 介導(dǎo)的一系列炎癥反應(yīng),。

內(nèi)毒素檢測方法：

內(nèi)毒素是一種生物類毒素與外源性致熱源,，當(dāng)人體內(nèi)的內(nèi)毒素水平超過一定范圍時會對人體造成嚴(yán)重危害，所以生物制品的內(nèi)毒素檢測尤為重要,。目前傳統(tǒng)的內(nèi)毒素檢測方法是家兔熱源法（RPT）,，即對家兔耳注射一定劑量的供試品后通過監(jiān)測家兔體溫檢測熱源即內(nèi)毒素，但這種方法不能檢測內(nèi)毒素含量,。鱟試劑試驗法（LAL）也是內(nèi)毒素的重要檢測方法之一,，在領(lǐng)域內(nèi)被廣泛采用，其原理是內(nèi)毒素可以激活鱟試劑中的 C 因子,、B 因子和前凝固蛋白,，而使之變成凝膠狀態(tài)，可以定量或者半定量地檢測內(nèi)毒素,。但是隨著鱟數(shù)量的減少,，其他替代方法也相繼出現(xiàn)，如單核細(xì)胞活性試驗（MAT）法,，該方法的原理為內(nèi)毒素可以激活人單核細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-6（IL-6）,，通過用ELISA 定量檢測 IL-6 進(jìn)行內(nèi)毒素的定量分析；生物傳感器是一種對生物性物質(zhì)敏感并可將其濃度或含量轉(zhuǎn)換為電信號進(jìn)行檢測的儀器,；重組C因子法也是一種內(nèi)毒素檢測方法,，重組C因子可以被內(nèi)毒素活化,，隨后和熒光底物相互作用產(chǎn)生熒光，通過對熒光信號的檢測實現(xiàn)內(nèi)毒素的定量分析,。此外,，還有研究人員采用色譜或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對內(nèi)毒素進(jìn)行分析。

內(nèi)毒素的去除方法：

①超濾法：超濾法是一種分子篩選技術(shù),，主要是利用濾膜的特殊結(jié)構(gòu)和性質(zhì)實現(xiàn)對物質(zhì)的分離,。內(nèi)毒素相對分子質(zhì)量較大，適用于去除小分子量物質(zhì)中的內(nèi)毒素,，選用合適的超濾膜去除溶液中的內(nèi)毒素,。如通常可以選擇截留分子量為10 kDa 的超濾膜對樣品中的內(nèi)毒素進(jìn)行去除,。超濾法具有操作簡便,、處理量大的優(yōu)點(diǎn)，但并不適用于含有較大相對分子質(zhì)量成分的樣品,。

②活性炭吸附法：活性炭是一種多孔介質(zhì),，具有比表面積大、吸附能力強(qiáng)的特性,，通過疏水作用對相對分子質(zhì)量較大的內(nèi)毒素進(jìn)行吸附,，在弱酸條件下去除效果更好，更適用于小分子溶液或低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)或肽溶液中內(nèi)毒素的去除,。但是活性炭的選擇性較差,，對溶液中的活性成分也有吸附作用，并且吸附后溶液中殘留活性炭的去除較為困難,，因此目前使用較少,。

③萃取法：有些生物制品的有效成分為帶負(fù)電荷的生物大分子，并且含多糖結(jié)構(gòu),，細(xì)菌內(nèi)毒素不易去除,，而萃取法利用目標(biāo)分子或樣品在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度的不同而達(dá)到分離目的，因此可以在細(xì)菌內(nèi)毒素去除中應(yīng)用,。如可以用 TritonX-114 對內(nèi)毒素進(jìn)行萃取,，TritonX-114是非離子表面活性劑，在低溫條件下,，可以溶于水中并與內(nèi)毒素分子結(jié)合,，在溫度升高的過程中，TritonX-114 的溶解度會逐漸下降,，當(dāng)溫度超過 25 ℃時，TritonX-114會和內(nèi)毒素一起形成沉淀,，實現(xiàn)樣品中內(nèi)毒素的去除,。

④荷電微孔濾膜法：荷電微孔濾膜是一種帶有正電荷的濾膜,，能夠吸附帶負(fù)電荷的物質(zhì)。細(xì)菌內(nèi)毒素的磷脂部分帶負(fù)電荷,，因此荷電微孔濾膜可以對其進(jìn)行吸附,，從而達(dá)到去除內(nèi)毒素的目的。需注意使用該方法時內(nèi)毒素的脫除率與荷電膜的孔徑及溶液的pH有關(guān),，需對這些條件進(jìn)行優(yōu)化已達(dá)到最有的脫除效率,。

⑤離子交換色譜法：內(nèi)毒素在 pH ＞ 1.3 的情況下帶負(fù)電荷，因此可以利用這一原理與陰離子交換色譜發(fā)生相互作用,，柱上的內(nèi)毒素可以用高鹽緩沖液或 NaOH 去除,。離子交換色譜法具有成本低、吸附容量大的特點(diǎn),，但若溶液中有效成分存在其他負(fù)電荷離子,，則不適合采用該方法進(jìn)行內(nèi)毒素去除，否則可能會導(dǎo)致有效成分損失,。

⑥親和色譜法：親和色譜法是通過物質(zhì)之間的親和作用,，運(yùn)用生物大分子可以特異性識別特定的物質(zhì)并且進(jìn)行特異性結(jié)合的原理來進(jìn)行某種物質(zhì)的分離的方法，此方法對物質(zhì)的分離主要取決于親和配基,，因此選用可以與內(nèi)毒素分子特異性結(jié)合的配基可以達(dá)到去除內(nèi)毒素的目的,。研究發(fā)現(xiàn)，以多粘菌素B ,、組氨酸,、聚賴氨酸、絲氨酸,、殼聚糖為配基的親和層析法對細(xì)菌內(nèi)毒素有良好的吸附效果,，可以有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素。親和層析法因?qū)?nèi)毒素有良好的選擇性,，因此可有效降低溶液有效分子的損失,。

各種去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法不是孤立的，可以相互結(jié)合使用,，在設(shè)計整個工藝流程時需要考慮到每一個步驟對內(nèi)毒素的去除效果以及不同來源樣品的內(nèi)毒素在性質(zhì)上的區(qū)別,，需要結(jié)合工藝流程和特殊性質(zhì)進(jìn)行確定。

生物制品中內(nèi)毒素檢測方法及去除工藝

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