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蛋白質(zhì)280nm/254nm雙波長(zhǎng)測(cè)定：

蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸,、色氨酸等芳香族氨基酸,。它們具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280nm波長(zhǎng)處,，且在此波長(zhǎng)內(nèi)吸收峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系,，故可作為蛋白質(zhì)定性、定量測(cè)定的依據(jù),，正因?yàn)槿绱耍?80nm處的紫外吸收法通常被用于層析系統(tǒng)中蛋白質(zhì)濃度的連續(xù)監(jiān)控,。但由于各種蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要準(zhǔn)確定量,，必需要有待測(cè)蛋白質(zhì)的純品作為標(biāo)準(zhǔn)來比較,，或且已經(jīng)知道其消光系數(shù)作為參考,。另外，不少非蛋白物質(zhì)在280nm波長(zhǎng)下也有-定吸收能力,，可能發(fā)生干擾,。其中尤以核酸（嘌呤和嘧啶堿）的影響更為嚴(yán)重。在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克）,，但核酸在254nm處的吸收更強(qiáng),，其吸收高峰在254nm附近。核酸254nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍,，

而蛋白質(zhì)則相反,，280nm紫外吸收值大于254nm的吸收值。

通常：

純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A254》1.8

純核酸的光吸收比值：A280/A254《0.5

因此蛋白質(zhì)溶液中同時(shí)存在核酸時(shí)（生物體系大多數(shù)如此）,，必須同時(shí)測(cè)定OD254nm，與OD280nm,。然后根據(jù)兩種波長(zhǎng)的吸收度的比值，通過經(jīng)驗(yàn)公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實(shí)含量,。

蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280－0.74×A254（mg/ml）

此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來建立的,。