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離子色譜/脈沖安培法測定奶粉中低聚果糖含量
摘要：本文建立了測定奶粉中的低聚果糖含量的離子色譜方法,。該方法以 Hamilton RCX-30 - 250/4.6 為色譜柱，氫氧化鈉和醋酸鈉為流動相梯度洗脫,，采用脈沖安培法進行檢測。果糖在 0.08 mg/L～35 mg/L 濃度范圍內(nèi)顯示了良好的線性關(guān)系,，加標(biāo)回收率在 90%左右,。采用電化學(xué)檢測是一種簡單快速、高靈敏,、抗干擾的分析方法,。
關(guān)鍵詞：離子色譜法；低聚果糖,；奶粉; 脈沖安培檢測
1. 引言
低聚果糖又稱蔗果低聚糖,，是由 1～3 個果糖基通過 β(2—1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物[1],。低聚果糖是一種天然活性物質(zhì),，具有調(diào)節(jié)腸道菌群，增殖雙歧桿菌，促進鈣的吸收,，調(diào)節(jié)血脂,，免疫調(diào)節(jié)，抗齲齒等保健功能 [2],。作為添加雙歧因子（低聚半乳糖,，低聚果糖）,低聚果糖常添加于奶粉中以增強產(chǎn)品的營養(yǎng)功能。目前在寡糖類物質(zhì)的分析方面,，主要有三類方法：酶學(xué)法,、化學(xué)法和色譜法。酶學(xué)法具有非常靈敏和高特異性等特點,，但容易受樣品中污染物干擾,，并且酶的來源和純化也有困難?；瘜W(xué)法在分析糖類物質(zhì)時只能測定出總糖和還原糖的含量,。色譜法則可將各種低聚糖相互分離和分別定量，常用于糖分析的色譜方法有氣相色譜法,、液相色譜法,、液質(zhì)聯(lián)用、毛細管電泳法,、離子色譜法等[3],。離子色譜分離結(jié)合脈沖安培檢測是目前糖分析的理想方法，該方法基于糖在堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進行分離[4-6],，方法抗干擾性強,，靈敏度高。
2. 實驗部分
2.1 儀器與試劑
Metrohm 850 離子色譜儀,；858 自動樣品處理系統(tǒng),；安培檢測器，配有金工作電極和鈀參比電極,；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：MagIC Net 2.3 Professional,。氫氧化鈉溶液（50–52%，F(xiàn)luka 72064）,；NaAc(優(yōu)級純,Sigma 71183),；果糖（98%,分析純）；馬來酸（C4H4O4,，分析純）,；硼氫化鈉（NaBH4，分析純）,；冰乙酸（CH3COOH,，分析純）；三水乙酸鈉（CH3COONa•3H2O，分析純）,；菊粉(低聚果糖含量 96.3%),；低聚果糖試劑盒：蔗糖混合酶（其中蔗糖酶 100U，β -淀粉酶 500 U,，支鏈淀粉酶 100U,，麥芽糖酶 1000U）；果聚糖混合酶（外切 1000U,，內(nèi)切 100U）：其中果糖和蔗糖的含量均不超過 0.005%,， Megazyme；超純水（電阻率>18 MΩ·cm,，25 °C),。 2.2 試劑配制馬來酸鈉緩沖溶液（100mmol/L，pH6.5）：稱取 1.16g 馬來酸于 150mL 燒杯中,，加入約 70mL 水溶解,，用 1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 值 6.5，用水稀釋至 100mL,。4℃保存,，可放置 3 個月蔗糖混合酶溶液（蔗糖酶約 4.5U/mL，β-淀粉酶約 23U/mL,，支鏈淀粉酶約 4.5U/mL,，麥芽糖酶約 45U/mL）：將 1 瓶蔗糖復(fù)合酶溶解在 22mL 馬來酸鈉緩沖溶液，分裝到 2mL 的聚丙烯的試管中,，-20℃保存,，可放置 6 個月。氫氧化鈉溶液（50mmol/L）：稱取 2g 氫氧化鈉（至 0.1g）,，溶于水溶解并用水稀釋至 1000mL,。硼氫化鈉溶液（10mg/mL）：稱取 50mg 硼氫化鈉于聚丙烯試管中，用 50mmol/L 氫氧化鈉溶液溶解,，zui終濃度為 10mg/mL,，用時現(xiàn)配。乙酸溶液（0.2mol/L）：吸取 0.6mL 冰乙酸,，用水稀釋至 50mL。乙酸鈉溶液（0.2mol/L）：稱取 1.36 三水乙酸鈉（至 0.01g）,，溶于水溶解并用水稀釋至 50mL,。乙酸鈉緩沖溶液：吸取 14mL 乙酸溶液和 11mL 乙酸鈉溶液混合，并用水稀釋至 50mL,。果聚糖混合酶溶液（約外切 45.5U/mL,，內(nèi)切 4.55U/mL）：將 1 瓶果聚糖混合酶溶解在 22mL 乙酸鈉緩沖溶液，分裝到 2mL 的聚丙烯的試管中，-20℃保存,，可放置 6 個月,。果糖標(biāo)準溶液：稱取果糖 0.0110g，,，用超純水定容到 50ml,，制得果糖 215.6 mg/L 標(biāo)準溶液，逐級稀釋得到濃度為 0.086,，0.172,，0.431，0.862,，1.725,，3.450，8.624,，17.248,，34.496mg/L 的標(biāo)準工作溶液。 2.3 樣品制備將奶粉混勻,，準確稱取奶粉 S1-2 約 1.2g,，奶粉 S1-3 約 1.0g（至 0.1mg，至少含有低聚果糖 20mg）于 150mL 燒杯中,，加入 80℃熱水約 50mL,，置于 80℃恒溫水浴振蕩器中，振搖 15min 后,，取出,，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至 100mL 容量瓶中,，用水分三次沖洗燒杯,，用水定容，搖勻,，溶液經(jīng)濾紙過濾,，取 500μL 上清液于 25mL 容量瓶中，加入 1000μL 蔗糖酶溶液,，搖勻,，置于 40℃水浴中，每隔 10min 振搖 10s,，酶解 60min 后,，加入 500μL 硼氫化鈉溶液，搖勻,，置于 40℃水浴中,，每隔 10min 振搖 10s,，反應(yīng) 30min 后，取出,，冷卻至室溫,，加入 1.25mL 0.2mol/L 乙酸溶液，搖勻,，靜置 10min,，加入 250μL 果聚糖酶，搖勻,，置于 40℃ 水浴中,，每隔 10min 振搖 10s，反應(yīng) 30min 后,，取出,，冷卻至室溫。用水定容至刻度線,，樣液依次通過 0.45μm 水相濾膜和 RP 柱,，棄去前面 6mL，收集后面洗脫液待測,。準確稱取菊粉 1.6g,，溶解并定容在 100ml 容量瓶中，回收率實驗時在稱好的樣品中添加菊粉(1ml 相當(dāng)于果糖 2.505mg/L),，其它步驟相同,，與樣品一起處理。 2.4 色譜條件色譜柱：Hamilton RCX-30 - 250/4.6,；淋洗液采用高壓梯度模式：NaOH 90 mmol/L (0-22min),；NaOH 150 mmol/L+ 500 mmol/L NaAc(22-35min)；NaOH 90 mmol/L (35-60min),。流速：1.0 mL/min,；柱溫：32℃；進樣量：20 μL,；檢測方式：脈沖安培法檢測,，檢測溫度： 35℃。檢測波形參數(shù)：E1=0.05 V,；E2=0.55 V,； E3=-0.1 V；t1=300 ms,； t2=50 ms,；t3=200 ms。
3. 結(jié)果與討論
3.1 色譜條件選擇
離子色譜法測定糖類物質(zhì)是通過將其在堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進行分離,，本文選用 Hamilton RCX-30 - 250/4.6 色譜柱,，對于果糖與其余單雙糖的分離效果良好。大部分添加低聚果糖的食品中會含有一些單雙糖,，同時前處理過程中也會產(chǎn)生葡萄糖等單糖,，而這些單雙糖也會影響到低聚果糖的分離，因此在試驗中必須使用梯度洗脫程序,，既能達到較好的分離,，也能使分析時間縮短。
3.2 標(biāo)準曲線與檢出限
在 2.4 色譜條件下,，將不同濃度果糖標(biāo)準溶液依次進樣分析,，以被測糖的質(zhì)量濃度 Q( mg /L) 對相應(yīng)的峰面積 A 作標(biāo)準曲線，分別得到線性方程為 A=1.12752+1.94065,，線性相關(guān)系數(shù)為 0.9994,，線性范圍可達到 4 個數(shù)量級，按照 3 倍信噪比計算檢出限為 0.0694mg/L,。
3.3 樣品分析
本文對兩種奶粉樣品進行了分析,，實際色譜分析的是樣品處理后的果糖含量，結(jié)果計算時果糖與低聚果糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)為 1.23,，得到檢測值分別為 3.25%和 5.73%,，與標(biāo)示值接近，表明此方法可行性好,。圖 1 是奶粉樣品溶液色譜圖,。圖 1 奶粉 S1-2 色譜圖選用奶粉樣品 S1-2，精密稱定,，并分別加入高,、中、低 3 種濃度的菊粉溶液,，充分混勻,，按照本實驗方法進行前處理后測定，平行測定 6 份,，平均回收率均在 90%以上,，結(jié)果見表 1. 表 1 奶粉 S1-2 回收率與精密度測定結(jié)果樣品名稱 樣品含量(mg/L) 加標(biāo)量(mg/L) 平均回收率（%）， n=6 RSD% S1-2 6.36 2.505 96.49 0.34 5.010 93.01 2.12 7.515 91.71 0.89
4. 結(jié)論
本文采用離子色譜分離,，脈沖安培檢測法測定了奶粉中的低聚果糖,，采用優(yōu)化的梯度洗脫程序，有效分離了葡萄糖,、果糖和蔗糖,。該方法靈敏度高，線性范圍寬,，有較好的精密度和準確度,，可用于奶粉等食品樣品中低聚果糖含量的日常分析,。
參考文獻
[1] 陳亞非，羅琪珊,，葛亞中,。低聚果糖調(diào)節(jié)機體免疫功能作用的進展[J]。現(xiàn)代食品科技,，2003,，21（4）： 83-87
[2]楊正梅，卜友泉,，何瑞國,。低聚果糖的生物學(xué)效應(yīng)及其安全性研究進展[J].生命科學(xué)研究，2004,，8（4）： 122-126
[3]劉修鵬,。離子色譜法測定食品中低聚果糖和飲用水中 F -、Cl-,、NO3 -和 SO4 2-的研究[D].碩士學(xué)位論文,，2007.
[4]王美菡，李敏,，郭健,，劉修鵬。離子交換色譜法測定保健食品中低聚果糖含量[J],。中國衛(wèi)生檢驗雜志,， 2007，17（6）：961-963
[5]張績覓,，劉玉峰,，唐華澄，李東,。離子色譜法測定食品中低聚果糖的含量[J].,。食品研究與開發(fā)，2012,， 33(1):135-138
[6]AOAC Official Method 997.08. Fructans in food products ion exchangechromatographic method[EB]
關(guān)鍵詞：離子色譜法；低聚果糖,；奶粉; 脈沖安培檢測
1. 引言
低聚果糖又稱蔗果低聚糖,，是由 1～3 個果糖基通過 β(2—1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物[1],。低聚果糖是一種天然活性物質(zhì),，具有調(diào)節(jié)腸道菌群，增殖雙歧桿菌，促進鈣的吸收,，調(diào)節(jié)血脂,，免疫調(diào)節(jié)，抗齲齒等保健功能 [2],。作為添加雙歧因子（低聚半乳糖,，低聚果糖）,低聚果糖常添加于奶粉中以增強產(chǎn)品的營養(yǎng)功能。目前在寡糖類物質(zhì)的分析方面,，主要有三類方法：酶學(xué)法,、化學(xué)法和色譜法。酶學(xué)法具有非常靈敏和高特異性等特點,，但容易受樣品中污染物干擾,，并且酶的來源和純化也有困難?；瘜W(xué)法在分析糖類物質(zhì)時只能測定出總糖和還原糖的含量,。色譜法則可將各種低聚糖相互分離和分別定量，常用于糖分析的色譜方法有氣相色譜法,、液相色譜法,、液質(zhì)聯(lián)用、毛細管電泳法,、離子色譜法等[3],。離子色譜分離結(jié)合脈沖安培檢測是目前糖分析的理想方法，該方法基于糖在堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進行分離[4-6],，方法抗干擾性強,，靈敏度高。
2. 實驗部分
2.1 儀器與試劑
Metrohm 850 離子色譜儀,；858 自動樣品處理系統(tǒng),；安培檢測器，配有金工作電極和鈀參比電極,；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：MagIC Net 2.3 Professional,。氫氧化鈉溶液（50–52%，F(xiàn)luka 72064）,；NaAc(優(yōu)級純,Sigma 71183),；果糖（98%,分析純）；馬來酸（C4H4O4,，分析純）,；硼氫化鈉（NaBH4，分析純）,；冰乙酸（CH3COOH,，分析純）；三水乙酸鈉（CH3COONa•3H2O，分析純）,；菊粉(低聚果糖含量 96.3%),；低聚果糖試劑盒：蔗糖混合酶（其中蔗糖酶 100U，β -淀粉酶 500 U,，支鏈淀粉酶 100U,，麥芽糖酶 1000U）；果聚糖混合酶（外切 1000U,，內(nèi)切 100U）：其中果糖和蔗糖的含量均不超過 0.005%,， Megazyme；超純水（電阻率>18 MΩ·cm,，25 °C),。 2.2 試劑配制馬來酸鈉緩沖溶液（100mmol/L，pH6.5）：稱取 1.16g 馬來酸于 150mL 燒杯中,，加入約 70mL 水溶解,，用 1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 值 6.5，用水稀釋至 100mL,。4℃保存,，可放置 3 個月蔗糖混合酶溶液（蔗糖酶約 4.5U/mL，β-淀粉酶約 23U/mL,，支鏈淀粉酶約 4.5U/mL,，麥芽糖酶約 45U/mL）：將 1 瓶蔗糖復(fù)合酶溶解在 22mL 馬來酸鈉緩沖溶液，分裝到 2mL 的聚丙烯的試管中,，-20℃保存,，可放置 6 個月。氫氧化鈉溶液（50mmol/L）：稱取 2g 氫氧化鈉（至 0.1g）,，溶于水溶解并用水稀釋至 1000mL,。硼氫化鈉溶液（10mg/mL）：稱取 50mg 硼氫化鈉于聚丙烯試管中，用 50mmol/L 氫氧化鈉溶液溶解,，zui終濃度為 10mg/mL,，用時現(xiàn)配。乙酸溶液（0.2mol/L）：吸取 0.6mL 冰乙酸,，用水稀釋至 50mL。乙酸鈉溶液（0.2mol/L）：稱取 1.36 三水乙酸鈉（至 0.01g）,，溶于水溶解并用水稀釋至 50mL,。乙酸鈉緩沖溶液：吸取 14mL 乙酸溶液和 11mL 乙酸鈉溶液混合，并用水稀釋至 50mL,。果聚糖混合酶溶液（約外切 45.5U/mL,，內(nèi)切 4.55U/mL）：將 1 瓶果聚糖混合酶溶解在 22mL 乙酸鈉緩沖溶液，分裝到 2mL 的聚丙烯的試管中，-20℃保存,，可放置 6 個月,。果糖標(biāo)準溶液：稱取果糖 0.0110g，,，用超純水定容到 50ml,，制得果糖 215.6 mg/L 標(biāo)準溶液，逐級稀釋得到濃度為 0.086,，0.172,，0.431，0.862,，1.725,，3.450，8.624,，17.248,，34.496mg/L 的標(biāo)準工作溶液。 2.3 樣品制備將奶粉混勻,，準確稱取奶粉 S1-2 約 1.2g,，奶粉 S1-3 約 1.0g（至 0.1mg，至少含有低聚果糖 20mg）于 150mL 燒杯中,，加入 80℃熱水約 50mL,，置于 80℃恒溫水浴振蕩器中，振搖 15min 后,，取出,，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至 100mL 容量瓶中,，用水分三次沖洗燒杯,，用水定容，搖勻,，溶液經(jīng)濾紙過濾,，取 500μL 上清液于 25mL 容量瓶中，加入 1000μL 蔗糖酶溶液,，搖勻,，置于 40℃水浴中，每隔 10min 振搖 10s,，酶解 60min 后,，加入 500μL 硼氫化鈉溶液，搖勻,，置于 40℃水浴中,，每隔 10min 振搖 10s,，反應(yīng) 30min 后，取出,，冷卻至室溫,，加入 1.25mL 0.2mol/L 乙酸溶液，搖勻,，靜置 10min,，加入 250μL 果聚糖酶，搖勻,，置于 40℃ 水浴中,，每隔 10min 振搖 10s，反應(yīng) 30min 后,，取出,，冷卻至室溫。用水定容至刻度線,，樣液依次通過 0.45μm 水相濾膜和 RP 柱,，棄去前面 6mL，收集后面洗脫液待測,。準確稱取菊粉 1.6g,，溶解并定容在 100ml 容量瓶中，回收率實驗時在稱好的樣品中添加菊粉(1ml 相當(dāng)于果糖 2.505mg/L),，其它步驟相同,，與樣品一起處理。 2.4 色譜條件色譜柱：Hamilton RCX-30 - 250/4.6,；淋洗液采用高壓梯度模式：NaOH 90 mmol/L (0-22min),；NaOH 150 mmol/L+ 500 mmol/L NaAc(22-35min)；NaOH 90 mmol/L (35-60min),。流速：1.0 mL/min,；柱溫：32℃；進樣量：20 μL,；檢測方式：脈沖安培法檢測,，檢測溫度： 35℃。檢測波形參數(shù)：E1=0.05 V,；E2=0.55 V,； E3=-0.1 V；t1=300 ms,； t2=50 ms,；t3=200 ms。
3. 結(jié)果與討論
3.1 色譜條件選擇
離子色譜法測定糖類物質(zhì)是通過將其在堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進行分離,，本文選用 Hamilton RCX-30 - 250/4.6 色譜柱,，對于果糖與其余單雙糖的分離效果良好。大部分添加低聚果糖的食品中會含有一些單雙糖,，同時前處理過程中也會產(chǎn)生葡萄糖等單糖,，而這些單雙糖也會影響到低聚果糖的分離，因此在試驗中必須使用梯度洗脫程序,，既能達到較好的分離,，也能使分析時間縮短。
3.2 標(biāo)準曲線與檢出限
在 2.4 色譜條件下,，將不同濃度果糖標(biāo)準溶液依次進樣分析,，以被測糖的質(zhì)量濃度 Q( mg /L) 對相應(yīng)的峰面積 A 作標(biāo)準曲線，分別得到線性方程為 A=1.12752+1.94065,，線性相關(guān)系數(shù)為 0.9994,，線性范圍可達到 4 個數(shù)量級，按照 3 倍信噪比計算檢出限為 0.0694mg/L,。
3.3 樣品分析
本文對兩種奶粉樣品進行了分析,，實際色譜分析的是樣品處理后的果糖含量，結(jié)果計算時果糖與低聚果糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)為 1.23,，得到檢測值分別為 3.25%和 5.73%,，與標(biāo)示值接近，表明此方法可行性好,。圖 1 是奶粉樣品溶液色譜圖,。圖 1 奶粉 S1-2 色譜圖選用奶粉樣品 S1-2，精密稱定,，并分別加入高,、中、低 3 種濃度的菊粉溶液,，充分混勻,，按照本實驗方法進行前處理后測定，平行測定 6 份,，平均回收率均在 90%以上,，結(jié)果見表 1. 表 1 奶粉 S1-2 回收率與精密度測定結(jié)果樣品名稱 樣品含量(mg/L) 加標(biāo)量(mg/L) 平均回收率（%）， n=6 RSD% S1-2 6.36 2.505 96.49 0.34 5.010 93.01 2.12 7.515 91.71 0.89
4. 結(jié)論
本文采用離子色譜分離,，脈沖安培檢測法測定了奶粉中的低聚果糖,，采用優(yōu)化的梯度洗脫程序，有效分離了葡萄糖,、果糖和蔗糖,。該方法靈敏度高，線性范圍寬,，有較好的精密度和準確度,，可用于奶粉等食品樣品中低聚果糖含量的日常分析,。
參考文獻
[1] 陳亞非，羅琪珊,，葛亞中,。低聚果糖調(diào)節(jié)機體免疫功能作用的進展[J]。現(xiàn)代食品科技,，2003,，21（4）： 83-87
[2]楊正梅，卜友泉,，何瑞國,。低聚果糖的生物學(xué)效應(yīng)及其安全性研究進展[J].生命科學(xué)研究，2004,，8（4）： 122-126
[3]劉修鵬,。離子色譜法測定食品中低聚果糖和飲用水中 F -、Cl-,、NO3 -和 SO4 2-的研究[D].碩士學(xué)位論文,，2007.
[4]王美菡，李敏,，郭健,，劉修鵬。離子交換色譜法測定保健食品中低聚果糖含量[J],。中國衛(wèi)生檢驗雜志,， 2007，17（6）：961-963
[5]張績覓,，劉玉峰,，唐華澄，李東,。離子色譜法測定食品中低聚果糖的含量[J].,。食品研究與開發(fā)，2012,， 33(1):135-138
[6]AOAC Official Method 997.08. Fructans in food products ion exchangechromatographic method[EB]