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如今，CRISPR技術(shù)已經(jīng)用于許多植物基因組的改造，包括的模式生物,，如擬南芥和蒺藜苜蓿，以及重要的經(jīng)濟(jì)作物,，如馬鈴薯,、玉米,、小麥、水稻和蘑菇等,。盡管CRISPR系統(tǒng)在大多數(shù)物種中都通用,，但涉及到植物細(xì)胞的編輯，還是不能一成不變,。

Addgene的Joel McDade在此介紹了植物基因組的改造,，突出了CRISPR系統(tǒng)針對(duì)植物的特定改變，并概括了科研人員的植物基因組編輯工具,。

CRISPR的各個(gè)組分

總的來說,，之前的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)規(guī)則也適用于植物的基因編輯。不過,，常用的CRISPR質(zhì)?？赡苄枰鲆恍└淖儯拍茉谥参锛?xì)胞中起作用,。與其他模式系統(tǒng)一樣,，Cas9或Cas9變異體和單鏈向?qū)?/span>RNA（gRNA）的表達(dá)就足以修飾植物的基因組。

與其他生物一樣,，gRNA也是由~20個(gè)核苷酸的靶向序列和~75個(gè)核苷酸的支架序列組成,，不過驅(qū)動(dòng)gRNA表達(dá)的啟動(dòng)子則取決于所使用的細(xì)胞類型。在植物細(xì)胞中,，gRNA的表達(dá)可通過植物特異的RNA pol III啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng),，如AtU6、TaU6,、OsU6或OsU3,。Addgene提供了30多種不含gRNA的骨架，方便你插入靶向序列,，zui快構(gòu)建好載體,。

目前，研究人員已經(jīng)對(duì)一些Cas9變異體進(jìn)行密碼子優(yōu)化,，以加強(qiáng)在植物細(xì)胞中的翻譯,。同時(shí)，他們也使用缺乏核酸酶活性的Cas9激活物（如dCas9-VP64）或阻遏物（dCas9-KRAB 或dCas9-SRDX）來激活或抑制植物細(xì)胞中的目標(biāo)基因,。

Cas9表達(dá)通常是由植物來源的RNA pol II啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的,。舉個(gè)例子，常用的RNA pol II啟動(dòng)子包括花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子（CaMV 35S）或泛素啟動(dòng)子,。Addgene也提供了含有Cas9的質(zhì)粒,，可用于目標(biāo)基因的敲除、激活和抑制,。之前提到的許多不含gRNA的骨架也包含Cas9,，可同時(shí)表達(dá)Cas9和gRNA,。

將這些組分導(dǎo)入植物細(xì)胞

一旦萬事俱備，下一步就是將CRISPR組分導(dǎo)入細(xì)胞了,。記住,，這些組分的導(dǎo)入對(duì)任何實(shí)驗(yàn)而言都是至關(guān)重要的，若gRNA或Cas9表達(dá)失敗,，結(jié)果肯定不樂觀,。CRISPR組分可瞬時(shí)表達(dá)，也可穩(wěn)定表達(dá),，這取決于導(dǎo)入方法和細(xì)胞類型,。

你可以選擇用PEG（聚乙二醇）來導(dǎo)入CRISPR組分并瞬時(shí)表達(dá)，但這種方法于原生質(zhì)體細(xì)胞,，也就是細(xì)胞壁被去除的植物細(xì)胞。你也可以選擇農(nóng)桿菌介導(dǎo)的導(dǎo)入,，它利用農(nóng)桿菌作為載體,，將你感興趣的基因?qū)肽康募?xì)胞。Johannes Stuttmann實(shí)驗(yàn)室提供了pDGE Dicot Genome Editing Kit,，包含了各種帶有Cas9且與農(nóng)桿菌兼容的載體,。

對(duì)于植物的基因組改造，盡管許多細(xì)節(jié)不同,，如啟動(dòng)子,、蛋白序列或轉(zhuǎn)染方法，但基本原理還是與其他系統(tǒng)無異,。目前已經(jīng)有很多文獻(xiàn)發(fā)表,，也有很多工具出現(xiàn)，因此你*不必?fù)?dān)心,。大膽地去試試吧