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噬菌體抗體文庫構(gòu)建
閱讀：1386 發(fā)布時間：2010-7-23總體上,，可以構(gòu)建兩大類抗體文庫：免疫文庫或天然文庫,。免疫文庫是用免疫球蛋白（Ig）可變區(qū)（V）基因制備而成的，這些基因或來自免疫人群,，或來自小鼠,；其中的V基因高度偏向于能識別免疫原的抗體。因而,，免疫文庫中分離的抗體親和力,，遠高于那些分離自同等規(guī)模天然文庫的抗體。這些抗體文庫同樣可用來選擇針對非免疫抗原的抗體,。天然文庫的構(gòu)建意圖是讓抗體文庫沒有偏好性,，從而可以從中選擇到針對各種各樣抗原的抗體。它們或來自天然的未免疫人體的重排V基因,，或來自合成的人V基因,。總體而言,，所選擇抗體的親和力與相應(yīng)的抗體文庫容量是成比例的,；其Kde值在較小抗體文庫的10-6～10-9mol/L到較大抗體文庫的10-9mol/L之間。這一發(fā)現(xiàn)與理論推測是一致的,。
對天然V基囪抗體文庫和合成的V基因抗體文庫進行比較可以發(fā)現(xiàn)：天然V基因文庫 與同樣規(guī)模的合成V基因抗體文庫相比,，可產(chǎn)生具有更高親和力的抗體。這也許是由于合 成文庫中所采用的互補決定區(qū)域（CDR）殘基不能為抗體結(jié)構(gòu)所接受,，或是由于產(chǎn)生了不能以高親和力結(jié)合的抗體結(jié)構(gòu),。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以此方法制備合成行V區(qū)基因,，同樣可導(dǎo)致在可變區(qū)出現(xiàn)框移和終止密碼子。要解決此問題,，可以用三核苷酸替代單堿基來合成寡核苷酸,，盡管此項技術(shù)成本高昂且未廣泛普及。至于合成性scFv折疊不佳問題的解決,，可以先用一個能識別V區(qū)構(gòu)象表位的配體,，如蛋白A或蛋白L，除去預(yù)先選擇正確折疊的VH和VL基因（I．M．To mlinson）,，盡管這于已知能結(jié)合此類蛋白的VH和VL基因的抗體文庫構(gòu)建,。使用合成性V區(qū)基因的優(yōu)點是：可以挑選或工程化那些已知能在細菌中良好表達的V基因，盡管CDR區(qū)內(nèi)單個氨基酸改變也許會導(dǎo)致細菌表達水平的迥異?，F(xiàn)已用合成性三核苷酸技術(shù)建立了一個抗體文庫,。這個技術(shù)可以利用旁側(cè)限制性位點讓合成性序列插入CDR區(qū)的任何位置：這對于隨后的抗體親和力成熟尤其有用。
盡管在理論上,，抗體文庫的構(gòu)建有多種不同的選擇,，不過大多數(shù)已發(fā)表的研究工作傾向于按照一種業(yè)已嘗試并且驗證過的實驗方案進行。尤其是以絲狀噬菌體為基礎(chǔ)的噬菌粒載體以及用pⅢ作為展示蛋白,，幾乎成為了*,。大多數(shù)抗體文庫采用scFv模式，但也有一些采用Fab模式,。Fab包括兩條鏈,，即VH—CH1和VL-CL，需要將兩者組裝為一體,。另一方面,，scFv則是一條含有兩個V區(qū)結(jié)構(gòu)域的單鏈蛋白，其中這兩個結(jié)構(gòu)域通過一個柔性連接頭共價地結(jié)合在一起,。總體上,，F(xiàn)ab在噬菌體上更難組裝并也更可能降解,；其作為可溶性抗體片段的產(chǎn)量也更低；同時,，由于具有較大的編碼DNA分子,，因此，也更易出現(xiàn)噬菌體（粒）中DNA分子不穩(wěn)定的問題,。所有這些問題的產(chǎn)生都源于這樣一個事實：Fab含有兩條需要組裝的蛋白鏈,，而每條鏈的大小都與單個scFv相當。然而,，F(xiàn)ab似乎并不存在困擾scFv片段的二聚化或凝集問題,，而且,，有一個已發(fā)表的天然Fab文庫與許多已發(fā)表的scFv文庫相比似乎有同樣的效率。scFv的主要問題之一是其具有易于形成二聚體的傾向,，即一條scFv的VH與另外一條scFv的VL發(fā)生相互作用,。如果連接片段較短，這個問題將更加嚴重,。已有人利用這種二聚體的形成來構(gòu)建二聚化抗體（成為二體）,，其中的每個單體都可以表達不同的抗體特異性。這樣一個概念,，已擴展到每個噬菌體攜帶兩種抗體特異性的噬菌體抗體文庫的構(gòu)建之中,。
抗體結(jié)構(gòu)和用于噬菌體展示的重組形式。
被展示的重組抗體的基因結(jié)構(gòu),。
構(gòu)建于pⅢ上的以噬菌粒為基礎(chǔ)的scFv抗體文庫,。實際上，與肽庫不同,，所有抗體文庫都是在噬菌粒載體中構(gòu)建的,。隨后的載體優(yōu)化包括六組氨酸標簽的出現(xiàn)和表位標簽替換，都未從根本上改變這個載體的性質(zhì),。使用噬菌粒載體的原因有兩點：首先,，噬菌粒載體具有比噬菌體載體更高的轉(zhuǎn)化效率，因此可以構(gòu)建明顯大很多的抗體文庫,；其次,，噬菌粒展示基本上都是抗體片段的單價展示，這樣就允許依據(jù)結(jié)合常數(shù)對抗體進行更高的選擇,。采用噬菌粒載體必須用輔助噬菌體進行噬菌體救援,，輔助噬菌體可以反式提供其他的噬菌體蛋白。
pHENl噬菌體展示載體,。