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V區(qū)多樣性的來源
閱讀：682 發(fā)布時(shí)間：2010-7-23天然V區(qū)可以被看作是在經(jīng)歷過或未經(jīng)歷過抗原刺激的淋巴細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。結(jié)果,，有些擴(kuò)增的V基因?qū)?huì)是重排的肝系基因,，而另外的則含有B細(xì)胞與抗原相遇所誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變體。這些基因擴(kuò)增所用引物可以識(shí)別V基因的5’端scFv單鏈抗體和J基因的3’端或者是CI,?；駽Hl結(jié)構(gòu)域的5’端?？傮w上,，大多數(shù)天然來源的擴(kuò)增V區(qū)基因是功能性的，其中不包含終止密碼子或者框移,。這是因?yàn)锽細(xì)胞中非功能性V區(qū)轉(zhuǎn)錄會(huì)受到抑制,。應(yīng)當(dāng)注意的是，雜交瘤細(xì)胞中的情況并非如此,，瘤細(xì)胞中經(jīng)常會(huì)有非功能性V區(qū)出現(xiàn),。
合成性V區(qū)通常是用PCR構(gòu)建的,。這涉及用長(zhǎng)核苷酸引物將隨機(jī)的CDR3和框架區(qū)4添加到所克隆的免疫球蛋白基因3’端,。CDR3是通過擴(kuò)增引物中NNS構(gòu)建而成的,。這個(gè)設(shè)計(jì)可以產(chǎn)生編碼所有氨基酸的密碼子，同時(shí)也能使終止密碼子出現(xiàn)的數(shù)目zui小,。這樣的合成性V基因是以天然V基因?yàn)榛A(chǔ)的,，但在其CDR區(qū)卻含有合成性元件。所構(gòu)建的CDR3可長(zhǎng)可短,，變化很大,，這取決于擴(kuò)增所用寡核苷酸的大小。
擴(kuò)增和克隆天然V基因,。
現(xiàn)在已發(fā)表了多套各自不同的引物,，分別用來擴(kuò)增來自人類和小鼠的全長(zhǎng)天然V基因?？傮w上,，引物套型的建立傾向于使之盡可能識(shí)別更多的不同V基因。然而,，這也許并非上策,，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)在隨機(jī)挑出的克隆V基因與選擇的抗體V基因家族之間，存在差異,。這也許是因?yàn)楦鞣N不同V基因家族,，在噬菌體展示水平或其對(duì)大腸桿菌毒性大小方面有所不同。使用對(duì)選擇克隆中的V基因家族和成員有偏好的引物,，也許是有利的,。抗體文庫(kù)中V基因?qū)π〔糠衷诩?xì)菌中表達(dá)良好克隆的這種限制性,，看來并不會(huì)影響選擇能力,。
擴(kuò)增和克隆合成性V基因。
合成性V基因構(gòu)建自未重排的V基因節(jié)段,，其多樣性來自編碼CDR3的寡核苷酸的簡(jiǎn)并性,。本圖中所示CDR長(zhǎng)度范圍位于4～12個(gè)氨基酸之間，由寡核苷酸簡(jiǎn)并NNS（N指任何核苷酸,，S指C或G）所提供,。其他長(zhǎng)度以及寡核苷酸簡(jiǎn)并性的其他形式也有可能。