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公司動(dòng)態(tài)

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

閱讀:333          發(fā)布時(shí)間:2011-1-21

  可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂凝膠內(nèi)擴(kuò)散,,二者相遇,在比例合適處形成白色沉淀。基本類型有單向擴(kuò)散和雙向擴(kuò)散兩種,。
    (一)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Double immunodiffusion test)
    抗原和抗體加到瓊脂板上相對(duì)應(yīng)的孔中,兩者各自向四周擴(kuò)散,,如兩者相對(duì)應(yīng),,濃度比例合適,則經(jīng)一定時(shí)間后,,在抗原,、抗體孔之間出現(xiàn)清晰致密的白色沉淀線。每一抗原與其相對(duì)應(yīng)抗體只能形成一條沉淀線,,若同時(shí)含有若干對(duì)抗原抗體系統(tǒng),因其擴(kuò)散速度的不同,,可在瓊脂中出現(xiàn)多條沉淀線,。且根據(jù)沉淀線融合情況,還可鑒定兩種抗原是*相同還是部分相同,。所以,,可用此法來(lái)分析和鑒定標(biāo)本中多種抗原或抗體成份,并用以測(cè)定抗原或抗體的效價(jià),。

    【材料】羊抗人全血清,,小牛血清,正常人混合血清,,精制瓊脂粉,,生理鹽水、載玻片,,打孔器(直徑3mm),、濕盒、吸管等,。
    【方法】
    1,、用生理鹽水配制1.0~1.5%瓊脂,隔水煮沸使溶化,,用吸管吸取3.5ml趁熱澆于載玻片上,,制成瓊脂板。
    2,、待瓊脂凝固后,,按右圖用打 孔器打孔,并用針頭挑去孔中瓊脂(孔距為5mm)。
    3,、在①孔中加正常人混合血清,,在②孔中加小牛血清,③孔中加羊抗人全血清,,注意不要溢出,。
    4、將加好樣品的瓊脂板置于濕盒內(nèi),,于37℃溫箱內(nèi)放置24小時(shí)后觀察結(jié)果,。
   【結(jié)果】
觀察孔間沉淀線的數(shù)目與特征,一般可注意到以下幾種現(xiàn)象:
    1,、抗原與抗體孔間形成一條沉淀線,,說(shuō)明只有一種抗原與相對(duì)應(yīng)的抗體特異性結(jié)合,如出現(xiàn)數(shù)條沉淀線,,說(shuō)明有幾組不同的抗原和相對(duì)應(yīng)抗體相結(jié)合,。
    2、根據(jù)抗原的成份可有以下三種現(xiàn)象:(1)若二孔中的抗原相同,,與相應(yīng)抗體形成的沉淀線融合成弧形,;(2)若二孔中抗原不同,當(dāng)抗血清中分別含有與抗原相應(yīng)的抗體時(shí),,則形成的沉淀線相交叉,;(3)若兩孔中抗原部分相同,抗血清中有各相應(yīng)的抗體,,形成的沉淀線相切,。
    3、相應(yīng)抗原抗體所形成的沉淀線,,如二者濃度相當(dāng),,沉淀線在孔中央,二者濃度不當(dāng)時(shí),,則沉淀線偏向濃度低的一側(cè)
   (二)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Single immunodiffusion test)—人血清中IgG,、IgA、IgM的測(cè)定,。
    單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是一種定量試驗(yàn),,將抗體混合于瓊脂內(nèi),傾注于玻片或平皿上,,凝固后在瓊脂上打孔,,再將抗原標(biāo)本加入孔內(nèi),經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間,,在孔的周圍出現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物形成的沉淀環(huán),,環(huán)的大小與抗原含量和擴(kuò)散時(shí)間相關(guān),。用不同濃度的抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,則未知標(biāo)本中的抗原含量即可從準(zhǔn)標(biāo)曲線中求出,。本試驗(yàn)主要用于檢查血清中各種免疫球蛋白和補(bǔ)體成份的含量,。
   【材料】
IgG、IgA,、IgM免疫板,、參考血清、待檢血清,、微量加樣器(10微升),、量尺、紗布,、生理鹽水,、帶蓋方盤。
   【方法】
    1,、免疫瓊脂板制備:將1.5%瓊脂(用PH8.2,、0.05M的巴比妥緩沖液配成),加熱溶化,,待瓊脂冷至56℃加入適量抗血清(抗血清zui終稀釋度取決于抗血清所標(biāo)化的稀釋度),,混勻,制成厚1.5mm的瓊脂板,,待瓊脂凝固后打孔,孔徑為3mm,,孔距1~1.2cm,。
    2、稀釋參考血清及待檢血清:參考血清用0.5ml蒸餾水溶解后使用,,參考血清,、待檢血清稀釋按要求進(jìn)行。
    3,、加樣:將上述稀釋參考血清分別滴入相應(yīng)的抗體免疫板的一排孔內(nèi),,其余孔滴加待檢的稀釋血清,每個(gè)檢樣加兩個(gè)孔,,每孔滴加10微升,。
    4、擴(kuò)散:將免疫板置水平濕盤內(nèi),,放進(jìn)37℃溫箱,,IgG免疫板擴(kuò)散24小時(shí),IgA,、IgM板48小時(shí)后取出置黑色背景前觀察結(jié)果,,(如果沉淀環(huán)不清晰,,也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小時(shí)后觀察),必要時(shí)可以染色后觀察,。
    5,、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及血清標(biāo)本中IgG、IgA,、IgM定量測(cè)定:測(cè)量沉淀環(huán)直徑,。沉淀環(huán)直徑的大小除與抗原量相關(guān),還與分子量和擴(kuò)散時(shí)間有關(guān),。這種沉淀環(huán)直徑與抗原含量的關(guān)系不是直線相關(guān),,而是對(duì)數(shù)關(guān)系,這種關(guān)系有兩種計(jì)算方法:
   (1)Mancini曲線-適用于大分子抗原和長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)散(>48小時(shí))的結(jié)果處理,。使用方格計(jì)算紙劃線,,沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系。公式表示:C/d2 =K(C=抗原濃度,,d=沉淀環(huán)直徑,,K=常數(shù))。
   (2)Fehey曲線-適用于小分子抗原和較短時(shí)間(24小時(shí))擴(kuò)散的結(jié)果處理,。使用半對(duì)數(shù)紙劃線,,濃度的對(duì)數(shù)與沉淀環(huán)之間呈線性關(guān)系。公式表示:logC/d=K(C=抗原濃度,,d=沉淀環(huán)直徑,,K=常數(shù))。
   【結(jié)果】免疫球蛋白的含量用mg/ml表示,,不同批號(hào)的參考血清其免疫球蛋白含量不一,。

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