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質體快速檢定法
閱讀：475 發(fā)布時間：2010-11-23這個方法是以phenol 及chloroform 溶菌后直接進行電泳分析，并未將質體DNA與宿主細菌染色體DNA 分離,，得到的DNA 也不能用限制酶作用。但因其快速簡便，所以可藉的于短時間內檢定大量轉形株中質體DNA 的相對分子量,，以初步篩選帶有重組質體的轉形株。
藥品試劑：
LB/Amp plates （LB plate 添加100 μg/mL ampicillin）
1×NET （20 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0）
PCI （25:24:1）
RNase A （1 mg/mL）
1% agarose gel
方法步驟：
1） 由前一天轉形所得的轉形株中,，挑選12~24 個單一菌落,，在LB/Amp plate上劃數道短的橫線或斜線，同時也須要接種帶有載體pQE31 的菌株,，于37℃培養(yǎng)過夜或直至菌體長出,。
2） 以接種環(huán)將菌體刮下，懸濁在30 μL 1×NET 中，震蕩混合均勻,。
◆ 不要忘了pQE31/JM109,！
3） 加入30 μL PCI，劇烈震蕩,。
4） 以12,000 rpm 離心3 min （室溫）,。
5） 將上層液吸至另一支干凈離心管，加1 μL RNase A 及3 μL 10×追蹤染劑,，以50 V 進行電泳分析,。 由于樣品中有細菌染色體DNA，所以在加入樣品槽時需十分小心,，否則DNA 極易流失在電泳緩沖液中,。 電泳后，可由質體DNA 的泳動率知其相對分子量大小,?！?/div>
6） 選取帶有質體分子量大于pQE31 的菌落，接種于3 mL LB/Amp 液體培養(yǎng)基,，于37℃震蕩培養(yǎng)過夜,，以抽取質體，進行限制酶分析,。