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RNA
閱讀：285 發(fā)布時間：2010-11-23之前已分別構筑出GUS 基因的表現(xiàn)質體pQG11,，若要令啟動子T5promotor 的啟動受到更好的調控,，應進一步將pQG11 轉形至大腸桿菌M15[pREP4],。 M15[pREP4] 可持續(xù)表現(xiàn)lac repressor,，pQG11 上用以驅動GUS基因表現(xiàn)的T5 promoter 的活性將因而受到抑制,，但一旦加入IPTG 就能誘導GUS基因大量表現(xiàn)。 在這一節(jié)的實驗里,，我們將分別自經(jīng)IPTG 誘導與未經(jīng)誘導的pQG11/M15[pREP4] 菌體抽取total RNA,，以便以北方雜合反應分析GUS mRNA的表現(xiàn)情形。 下面所采用的方法適用于大腸桿菌及其他革蘭氏陰性菌total RNA的抽取,，實驗進行時先以lysozyme 分解細胞壁,，再以sodium dodecyl sulfate （SDS）裂解原生質膜 （Summers, 1970; Ausubel et al., 2005）；的后加入適量的氯化鈉溶液將SDS,、蛋白質及大腸桿菌的染色體DNA 一并沉淀下來,，并以離心法移除，存留于上清液的 則以酒精沉淀,。 實驗過程所使用的RNase 抑制劑為DEPC,。
儀器用具：恒溫震蕩培養(yǎng)箱37℃；冰??；微量離心機；分光光度計 （Hitachi U-1100 spectrophotometer）
藥品試劑：大腸桿菌菌株pQG11/M15[pREP4];LB 培養(yǎng)液;Ampicillin （100 mg/mL）;Kanamycin （25 mg/mL）;IPTG （1 M）;Protoplasting buffer （15 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.45 M sucrose; 8 mM EDTA, stored at 4℃）;Lysozyme （50 mg/mL）;Gram-negative lysing buffer （10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM NaCl; 1 mM sodium citrate; 1.5% SDS）;Diethylpyrocarbonate （DEPC）;飽和氯化鈉溶液 （以40 g氯化鈉溶解于100 mL dH2O/DEPC）;酒精及70%酒精
方法步驟：
大腸桿菌pQG11/M15[pREP4] 的培養(yǎng)：
1） 將pQG11/M15[pREP4] 接種于2 mL含ampicillin （100 μg/mL） 及kanamycin（25 μg/mL） 的LB培養(yǎng)液,，于37℃震蕩培養(yǎng)過夜,。
2） 隔日早晨，取0.5 mL pQG11/M15[pREP4] 過夜培養(yǎng)液,，加入25 mL 含有ampicillin （100 μg/mL） 與kanamycin （25 μg/mL） 的LB 培養(yǎng)液,，于37℃震蕩培養(yǎng)2 h。
3） 加入25 μL 1 M IPTG,，繼續(xù)放置于37℃震蕩培養(yǎng),。
4） 經(jīng)過4 h 后，取出pQG11/M15[pREP4] 培養(yǎng)液,，開始進行 制備工作,。
制備：注意！進行以下 制備實驗時，除了使用依上述步驟所準備的pQG11/M15[pREP4] 培養(yǎng)液外,，請記得向助教領取未經(jīng)IPTG 誘導的pQG11/M15[pREP4] 培養(yǎng)液當做對照組,。
1） 取出4 支1.5 mL 微量離心管，分別標示為I-1, I-2, U-1 與U-2,。
2） 取3 mL 經(jīng)IPTG 誘導的pQG11/M15[pREP4] 培養(yǎng)液平均分置于微量離心管I-1 與I-2,。
3） 取3 mL 未經(jīng)IPTG 誘導的pQG11/M15[pREP4] 培養(yǎng)液平均分置于微量離心管U-1 與U-2。
4） 以8,000 rpm （4℃） 離心5 min,，小心倒掉上清液,，并以微量移液器盡量吸掉殘留的液體。
5） 各加入0.5 mL protoplasting buffer,，以微量移液器將大腸桿菌充分懸浮,。
6） 再加入1 mL protoplasting buffer 與12 μL 50 mg/mL lysozyme，混合均勻的后,，移置于冰浴中作用15 min,。
7） 以7,000 rpm 于4℃離心5 min。
8） 小心倒出上清液,，并以微量移液器盡量吸掉殘留的液體,。
9） 各加入75 μL gram-negative lysing buffer 及2 μL DEPC，以微量移液器小心懸浮沉淀于管底的大腸桿菌原生質體,，并離心數(shù)秒,。 在以微量移液器懸浮大腸菌原生質體時，一旦pellet 被充分打散即應停止懸浮動作,，以避免大腸菌DNA 斷裂可能造成的問題,。 DEPC 可能是一種致癌物質，使用時請在抽氣櫥內操作,。
10） 將微量離心管放入37℃恒溫水槽作用5 min,。
11） 作用完畢的后，將離心管移到冰浴中靜置5 min,。
12） 加入38 μL 飽和氯化鈉溶液,，以手指頭輕彈管壁，充分混合均勻,。
13） 靜置于冰浴中作用10 min,，此時應有白色沉淀出現(xiàn)。
14） 以13,000 rpm 于4℃離心10 min,。
15） 將上清液移至新的微量離心管,，并加入0.3 mL 酒精。
16） 混合均勻后將離心管放置于 -20℃過夜,，以便沉淀,。 在酒精內相當穩(wěn)定,，若須長期保存，可停在這一步,。
17） 以14,000 rpm 于4℃離心15 min,。
18） 小心倒掉上清液后，加入300 μL 70%酒精,。
19） 以14,000 rpm 于4℃離心5 min 的后,，小心倒掉上清液。
20） 將微量離心管倒置于桌面上30 min,，以便風干,。
21） 將溶解于30 μL dH2O/DEPC。
22） 定量：取5 μL ,，加入995 μL dH2O/DEPC稀釋的后,，以分光光度計測其在260 nm與280 nm的吸光值 （記得使用石英測光管）,，并計算的濃度與A260/A280的比值,。 溶液在260 nm的吸光值為1.0 時，則濃度相當于40 μg/mL,，而其A260/A280的比值應為1.7~2.0 （DNA則為1.8 左右）,。 這四個 樣本將于后續(xù)實驗中，分別以甲醛洋菜膠體電泳進行分析