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谷胱甘肽瓊脂糖凝膠使用說(shuō)明
閱讀：6582 發(fā)布時(shí)間：2011-4-22| 提 供 商 | 上海源葉生物科技有限公司 | 資料大小 | 0K |
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Pgex載體表達(dá)的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶溶合，因此可以通過(guò)谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化,。Pgex是一類以谷胱甘肽（γ-谷胱甘肽半胱胺酰甘氨酸）作為底物，通過(guò)形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST對(duì)底物的親和力是亞豪摩爾級(jí)的,，因此谷胱甘肽固化瓊脂糖形成的親和層析樹脂GST及其融合蛋白的純化效率很高?？梢杂煤坞x谷胱甘肽的緩沖液洗脫結(jié)合GST融合蛋白,。樹脂用3mol/L NaCl的緩沖液再生。
谷胱甘肽瓊脂糖對(duì)GST融合蛋白的結(jié)合能力很強(qiáng)（每毫升柱床體積的樹脂能結(jié)合8毫克融合蛋白）,。
谷胱甘肽樹脂的處理
1. 輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器,，將樹脂混成勻漿
2. 取部分勻漿放入15ml聚丙烯管（每100ml 細(xì)菌培養(yǎng)物需要2ml勻漿）
3. 4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清,。
4. 在樹脂中加入10倍柱床體積的冷的PBS,，顛倒數(shù)次，混合均勻,，4℃ 500 g離心5分鐘,，小心去掉上清。
5. 每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS,，制成50%勻漿,，顛倒數(shù)次,，混合均勻，懸液冰上放置待用
制備細(xì)胞抽提物
6. 每100毫升培養(yǎng)基的細(xì)胞沉淀懸于4mlPBS
7. 加入溶菌酶至終濃度1mg/ml,冰上放置30分鐘
8. 用針筒將10ml 0.2%TritonX-100 強(qiáng)行注入黏的細(xì)胞裂解物中,，劇烈振動(dòng)數(shù)次均勻,。加入DNase和RNase至終濃度5ug/ml,4℃振動(dòng)溫育10分鐘，4℃3000g離心30分鐘,，去除不溶性細(xì)胞碎片,，上清轉(zhuǎn)移到一只新管中，加入DTT至終濃度1mmol/L
純化融合蛋白
9. 細(xì)胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合,，每100毫升細(xì)菌培養(yǎng)物加2ml樹脂,，于室溫輕搖30min
10. 混合物于4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
11. 沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS,，顛倒離心管數(shù)次混勻,，洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白。
12. 4℃以500g離心5分鐘,，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
13. 重復(fù)步驟11和12兩次
14. 合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫,，也可用凝血酶、腸激酶或Xa因子切割,，
用谷胱甘肽洗脫融合蛋白
a. 沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液,，室溫輕輕攪動(dòng)10min,洗脫樹脂上結(jié)合的蛋白。
b. 如步驟12離心,，上清（含洗脫的融合蛋白）移至管中,。
c. 重復(fù)步驟a和b，合并三次上清,。
蛋白酶解從結(jié)合的GST融合蛋白上揮手靶蛋白
a. 在結(jié)合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶,、腸激酶或Xa因子（根據(jù)融合蛋白中的位點(diǎn)選擇），每ml樹脂加入50單位溶于1mlPBS的蛋白酶,。顛倒離心管數(shù)次混勻,，室溫下振蕩2-16小時(shí)。用小規(guī)模試驗(yàn)確定時(shí)間,。
b. 4℃以500g離心5分鐘,，上清小心移至新管中。（GST仍結(jié)合在樹脂上,，而靶蛋白也在上清中,，仍需要奮力）
15. 10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質(zhì)組成
試劑配制
谷胱甘肽洗脫緩沖液：10mmol/L還原型谷胱甘肽
50mmol/L Tris-Cl（PH8.0）