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一,、基本原理
　　厭氧微生物在自然界分布廣泛,，種類繁多，作用也日益引起重視,。培養(yǎng)厭氧微生物的技術(shù)關(guān)鍵是要使該類微生物處于除去了氧或氧化還原勢低的環(huán)境中,。
　　焦性沒食子酸與堿性溶液作用后，形成堿性沒食子酸鹽,，在此反應(yīng)過程中能吸收氧氣而造成厭氧環(huán)境,；牛肉渣內(nèi)既含有不飽和脂肪酸能吸收氧，又含有谷胱甘肽（glutathione）能形成負(fù)氧化還原電位差,；厭氧罐是采用某種方法除去其中的氧,，例如將鎂與氧化鋅制成產(chǎn)氫氣袋，放入罐中加水反應(yīng)產(chǎn)生氫，鈀或鉑是催化劑,，在常溫下催化氫與氧化合成水,，則可除去密封的厭氧罐中的氧。
二,、器材
　　巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭狀芽孢桿菌，Clostridium pas- teurianum）,，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）,；
　　焦性沒食子酸，棉花,，10%NaOH,，滅菌的石蠟凡士林（1∶1），牛肉,，蛋白陳,，葡萄糖， NaCl,，肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,，小試管肉膏蛋白胨瓊脂斜面，厭氧罐,，催化劑袋,，氣體發(fā)生袋，指示劑袋,，滅菌的帶橡皮塞或螺旋帽的大試管,，滅菌的玻璃板（直徑比培養(yǎng)皿大3—4 cm），滅菌的滴管,，燒瓶,，刀等。
三,、操作步驟
　　1．焦性沒食子酸法
　?。?）大管套小管法在大試管中放入少許棉花和焦性沒食子酸，焦性沒食子酸的用量按它在過量堿液中能每克吸收100ml空氣中的氧來估計(jì),，本實(shí)驗(yàn)用量約0．5g,。接種巴氏芽孢梭菌在小試管肉膏蛋白胨瓊脂斜面上，迅速滴入10％的NaOH于大試管中,，使焦性沒食子酸潤濕,，并立即放入除掉棉塞已接種菌的小試管斜面（小試管口朝上），塞上橡皮塞或擰上螺旋帽,，置30℃培養(yǎng),。
　　（2）培養(yǎng)皿法取玻璃板一塊或用培養(yǎng)皿蓋，鋪上一薄層滅菌脫脂棉,，將1g焦性沒食子酸放于其上,。用肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基倒平板，待凝固稍干燥后,，在平板上一半劃線接種巴氏芽孢梭菌,，下一半劃線接種熒光假單胞菌，并在皿底用記號筆作好標(biāo)記,。滴加10％NaOH溶液約2ml于焦性沒食子酸上,，切勿使溶液溢出棉花，立即將已接種的平板覆蓋于玻璃板上或培養(yǎng)皿蓋上,，必須將脫脂棉全部罩住,，焦性沒食子酸反應(yīng)物切勿與培養(yǎng)基表面接觸，以溶化的石蠟凡士林液（即vaspar）密封皿底與玻璃板或皿蓋的接觸處,。置30℃溫箱培養(yǎng),。
　　2．皰肉培養(yǎng)基法
　　（1）取已除去筋膜,、脂肪的牛肉500g,，切成小方塊，置1000ml蒸餾水中,，以小火煮1小時(shí),，用紗布過濾，擠干肉汁,，將肉汁保留備用,。再將肉渣用絞肉機(jī)絞碎，或用刀切碎,，使其成細(xì)粒,。
　　（2）將保留的肉汁加蒸餾水,，使總體積為2000ml,，加入20g蛋白陳，2g葡萄糖,，5gNaCl和絞碎的肉渣,。置燒瓶中搖均勻，加熱使蛋白胨溶化,。
　?。?）取上層溶液調(diào)整pH為8．0，在燒瓶壁上用記號筆標(biāo)明瓶內(nèi)液體高度,，1．05kg/cm2,，121．3℃滅菌15分鐘后補(bǔ)足蒸發(fā)的水量，重新調(diào)整pH為8．0，再煮沸10—20分鐘,，補(bǔ)足水量,，再調(diào)整pH為7．4。
　?。?）把燒瓶內(nèi)容物搖勻,，將溶液和肉渣分裝于小試管中，肉渣約用,，應(yīng)用無菌手續(xù)加入已滅菌的石蠟凡士林,，以隔絕氧氣。
　?。?）接種前可將上述已做好的庖肉培養(yǎng)基煮沸10分鐘，以除去溶入的氧,，如果蓋有一層石蠟凡士林,，需將石蠟凡士林先在火焰邊微加熱，使其溶化,。在培養(yǎng)基手感不燙時(shí)按液體接種法接入巴氏芽孢梭菌,，然后將接種的試管垂直，使石蠟凡士林凝固而密封培養(yǎng)基,。再置30℃中培養(yǎng),。
　　3．厭氧罐培養(yǎng)法
　　（1）用肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平板,，凝固干燥后,，取兩個平板，每個平板一半邊劃線接種巴氏芽孢梭菌,，另一半邊劃線接種熒光假單胞菌,，并標(biāo)記好。取其中的一個已接種的平皿置于厭氧罐的培養(yǎng)皿支架上,，而后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐內(nèi),；另一個已接種的平皿置培養(yǎng)室30℃培養(yǎng)。
　?。?）剪開催化劑袋,，將催化劑倒入?yún)捬豕奚w下面的多孔催化劑盒內(nèi)，擰緊催化劑盒的盒蓋,。
　?。?）剪開氣體發(fā)生袋的切碎線處，并迅速將此氣體發(fā)生袋置罐內(nèi)金屬架的夾上,，再向袋中加入約10 ml水,。同時(shí)，由另一人配合，剪開指示劑袋,，將指示條暴露,，立即放進(jìn)罐內(nèi)。
　?。?）迅速蓋好厭氧罐的蓋,，將固定梁旋緊，置 30℃培養(yǎng),，如圖Ⅶ-11所示,。
四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告