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大鼠TT4 ELISA KiT
閱讀：779 發(fā)布時間：2010-1-22產(chǎn)品編號： EIA05319
使用前*閱讀說明書,。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于經(jīng)典酶聯(lián)夾心技術(shù)原理,，能測量大鼠總甲狀腺素（TT4）,，只能用于研究用途,，不得用于醫(yī)學(xué)診斷,。
工作原理
TT4全部由 甲狀腺 產(chǎn)生,，每天約產(chǎn)生80—100ug.血清中99．96％的TT4以與蛋白結(jié)合的形式存在，其中10％一90％與甲狀腺激素結(jié)合球蛋白（TBG）結(jié)合,。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（ELISA）,。預(yù)先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體也為多克隆抗體,，經(jīng)生物素（biotin）標(biāo)記,。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS或TBS洗滌,。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng),；經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關(guān),。
每套試劑盒中內(nèi)容（96T）
材料 數(shù)量
標(biāo)準(zhǔn)品 96T（2vial）
預(yù)包被抗體的96孔板 96T（8×12）
生物素標(biāo)記抗體 96T （1:100）
ABC（親和素-過氧化物酶復(fù)合物） 96T （1:100）
樣品稀釋液 96T×2
抗體稀釋液 96T×1
ABC稀釋液 96T×1
TMB顯色液A 96T×1
TMB顯色液B 96T×1
TMB終止液 96T×1
ELISA洗滌液 96T×1（1:25）
需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀,。
3． 自動洗板機,。
4． 單通道或多通道可調(diào)節(jié)移液器以及其吸頭。
5． 蒸餾水,，容量瓶等
6． 干凈的試管和Eppendof管,。
注意事項
1． 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
2． 配制各種試劑時,，切記混勻,！
3． 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底,。
4． 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測,。
5． 要嚴格避免操作過程中酶標(biāo)板干燥,。干燥會使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活！
6． 為免交叉污染,，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管,。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
樣品的準(zhǔn)備和保存
樣品如果不立即分析，應(yīng)分裝后冷凍保存,，且避免反復(fù)凍融,。
血清——用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時或4℃過夜,，離心1000×g 10分鐘,，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存,。
細胞培養(yǎng),、組織勻漿,、體液——離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存,。
樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱文獻了解標(biāo)本內(nèi)待測因子的含量,，決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測范圍,。樣品的稀釋應(yīng)有詳細記錄,。
試劑的準(zhǔn)備和保存
A. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和使用：在使用前2小時內(nèi)準(zhǔn)備。將凍干品管內(nèi)加入1ml樣品稀釋液,，*溶解后做倍比稀釋,。
稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品在2小時內(nèi)使用。
B．生物素標(biāo)記抗體工作液：在使用前2小時內(nèi)準(zhǔn)備,。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml）,。
2． 按10ul生物素標(biāo)記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻,。
C．親和素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）工作液的準(zhǔn)備：在使用前1小時內(nèi)準(zhǔn)備,。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實配時應(yīng)多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul親和素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液,。輕輕混勻,。
D. TMB顯色工作液的準(zhǔn)備：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液,。
操作程序
1． 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目,。
2． 將倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對照,。處理后的標(biāo)本按100ul每孔加入,。
3． 酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)90分鐘,。
4． 反應(yīng)后用自動洗板機吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；或甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下,。洗滌2次。
5． 將準(zhǔn)備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入,。37℃反應(yīng)60分鐘,。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右,。
7． 將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入,。37℃反應(yīng)30分鐘。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次,，每次浸泡1-2分鐘左右,。
9． 按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液,，37℃避光反應(yīng)，反應(yīng)過程中,，要經(jīng)常的觀察,，當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯時,，即可加入TMB終止液0.1ml/孔,。（顯色反應(yīng)zui長不要超過30分鐘）。
10． 用酶標(biāo)儀在450nm測定O.D.值,。
11． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對應(yīng)的濃度,。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了N倍,，其實際濃度應(yīng)該×N,。
操作程序總結(jié)：
準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,，37℃反應(yīng)90分鐘
洗板2次,，加入生物素化抗體工作液，37℃反應(yīng)60分鐘
洗板3次,，加入ABC工作液,，37℃反應(yīng)30分鐘
洗板5次，加入TMB顯色液,，37℃反應(yīng)
加入TMB終止液
30分鐘之內(nèi)讀OD值
計算標(biāo)本待測因子含量
檢測范圍：200nmol/L—3.12nmol/L
敏感性： ＜0.5 nmol /L
特異性： 系統(tǒng)和其它因子無交叉反應(yīng)
保存： -20℃ [短期內(nèi)（如兩周）可4℃]
有效期： 12個月（-20℃）
用途： 用于體外定量分析液體標(biāo)本（通用型）