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大鼠TRF ELISA KiT
閱讀：843 發(fā)布時間：2010-1-20產(chǎn)品編號： EIA06229
使用前*閱讀說明書,。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于經(jīng)典酶聯(lián)夾心技術(shù)原理,，能測量大鼠TRF,，只能用于研究用途,，不得用于醫(yī)學診斷,。
工作原理
TRF,，轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin）。轉(zhuǎn)鐵蛋白是血漿中主要的含鐵蛋白質(zhì),，負責運載由消化管吸收的鐵和由紅細胞降解釋放的鐵,。以TRF-Fe3+的復合物形式進入骨髓中，供成熟紅細胞的生成,。TRF分子量約7.7萬,，為單鏈糖蛋白，含糖量約6%,。TRF可逆地結(jié)合多價離子,，包括鐵、銅,、鋅,、鈷等。每一分子TRF可結(jié)合兩個三價鐵原子,。TRF主要由肝細胞合成,，半壽期為7天。血漿中TRF的濃度受鐵供應的調(diào)節(jié),，在缺鐵狀態(tài)時,，血漿TRF濃度上升，經(jīng)鐵有效治療后恢復到正常水平,。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（ELISA）,。預先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體也為多克隆抗體,，經(jīng)生物素（biotin）標記,。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌,。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應,；經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關(guān),。
每套試劑盒中內(nèi)容（96T）
材料 數(shù)量
標準品 重組凍干品×2
預包被抗體的96孔板 1板（8×12）
生物素標記抗體 0.12ml（1:100）
ABC（親和素-過氧化物酶復合物） 0.12ml（1:100）
樣品稀釋液 15ml×2
抗體稀釋液 12ml×1
ABC稀釋液 12ml×1
TMB顯色液 10ml×1
TMB終止液 10ml×1
ELISA洗滌液 15ml×1（1:25）
需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標準規(guī)格酶標儀,。
3． 自動洗板機,。
4． 單通道或多通道可調(diào)節(jié)移液器以及其吸頭。
5． 蒸餾水,，容量瓶等
6． 干凈的試管和Eppendof管,。
注意事項
1． 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
2． 配制各種試劑時,，切記混勻,！
3． 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底,。
4． 建議所有標準品、樣本都做雙份檢測,。
5． 要嚴格避免操作過程中酶標板干燥,。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活！
6． 為免交叉污染,，要避免重復使用手中的吸頭和試管,。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
樣品的準備和保存
樣品如果不立即分析，應分裝后冷凍保存,，且避免反復凍融,。
血清——用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時或4℃過夜,，離心1000×g 10分鐘,，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存,。
細胞培養(yǎng),、組織勻漿,、體液——離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存,。
樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱文獻了解標本內(nèi)待測因子的含量,，決定適當?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測范圍,。樣品的稀釋應有詳細記錄,。
試劑的準備和保存
A. 標準品的稀釋和使用：在使用前2小時內(nèi)準備。將凍干品管內(nèi)加入1ml樣品稀釋液,，*溶解后做倍比稀釋,。
稀釋后的標準品在2小時內(nèi)使用。
B．生物素標記抗體工作液：在使用前2小時內(nèi)準備,。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實際配制時應多配制0.1-0.2ml）,。
2． 按10ul生物素標記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻,。
C．親和素-過氧化物酶復合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內(nèi)準備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實配時應多配制0.1-0.2ml）,。
2． 按10ul親和素-過氧化物酶復合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液,。輕輕混勻。
D. TMB顯色工作液的準備：在使用之前30分鐘,，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液,。
操作程序
1． 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數(shù)目。
2． 將倍比稀釋的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中,，1孔只加樣品稀釋液的作為對照,。處理后的標本按100ul每孔加入。
3． 酶標板加上蓋,，37℃反應90分鐘,。
4． 反應后用自動洗板機吸去酶標板內(nèi)的液體；或甩去酶標板內(nèi)液體,，再對著吸水紙拍幾下,。洗滌2次。
5． 將準備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入,。37℃反應60分鐘,。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右,。
7． 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入,。37℃反應30分鐘。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次,，每次浸泡1-2分鐘左右,。
9． 按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液,，37℃避光反應，反應過程中,，要經(jīng)常的觀察,，當肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯時,，即可加入TMB終止液0.1ml/孔,。（顯色反應zui長不要超過30分鐘）。
10． 用酶標儀在450nm測定O.D.值,。
11． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度,。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了N倍,，其實際濃度應該×N,。
操作程序總結(jié)：
準備試劑，樣品和標準品
加入準備好的樣品和標準品,，37℃反應90分鐘
洗板2次,，加入生物素化抗體工作液，37℃反應60分鐘
洗板3次,，加入ABC工作液,，37℃反應30分鐘
洗板5次，加入TMB顯色液,，37℃反應
加入TMB終止液
30分鐘之內(nèi)讀OD值
計算標本待測因子含量
檢測范圍：800ng/ml→12.5ng/ml,。
敏感性： ＜3ng/ml
特異性： 系統(tǒng)和其它因子無交叉反應。
保存： -20℃ [短期內(nèi)（如兩周）可4℃]
有效期： 12個月（-20℃）,。
用途： 用于體外定量分析液體標本（通用型）,。
REFERENCES
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