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亞適劑量抗IgM抗體對B淋巴細(xì)胞的刺激較弱,，當(dāng)加人IL-4時(shí)，B淋巴細(xì)胞對亞適劑量抗IgM抗體刺激表現(xiàn)出明顯的DNA合成增加,，3H-TdR摻人量與IL-4含量相關(guān),。
（1）小鼠脾臟B細(xì)胞懸液的制備
1）取BALB／c或C57BL／6小鼠，常規(guī)方法分離脾臟淋巴細(xì)胞,。用Hanks液洗2次,；再用10％NBS-IMDM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107～2X107／mL。
2）去除粘附細(xì)胞：將上述脾細(xì)胞懸液置24孔培養(yǎng)板,，每孔1～1．5mL,，置37cC，5％C02溫箱中培養(yǎng)1h,；將細(xì)胞懸液移至另外培養(yǎng)孔內(nèi),，繼續(xù)培養(yǎng)1h，收集非粘附脾細(xì)胞,；亦可通過SephadexG-10柱去除粘附細(xì)胞,。
3）去除T細(xì)胞：調(diào)整細(xì)胞濃度至5X107／mL，按1：40（V／V）加入抗小鼠T細(xì)胞血清或抗Thy-1,，2McAb,，置4~C 30min后,，按1：15（V／V）加入新鮮豚鼠混合血清，充分混勻后溫育1h,；離心棄上清,，用無血清培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。此時(shí)T細(xì)胞已死亡破碎,，通過淋巴細(xì)胞分層液,，低速離心予以去除。
4）B細(xì)胞的相對純化：用淋巴細(xì)胞分層液500—800r／min離心6—8min,，將上述細(xì)胞懸液再次純化,；用Hanks液洗1—2次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1X106—2X106／mL,。
（2）誘生上清IL-4含量的測定
1）將上述B細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板,，100~tL／孔，分別加入待測IL-4誘生上清或不同量標(biāo)準(zhǔn)品rlL-4,，其濃度為每毫升0．5U,、1U、2U,、3U,、4U、5U,、6U,，各組均設(shè)3復(fù)孔。
2）加亞適劑量抗IgM抗體,，一般終濃度0．5％（V／V）為抗IgM的亞適劑量,，也可在實(shí)驗(yàn)前自行測定。
3）常規(guī)培養(yǎng)48～72h,，結(jié)束前8-16h加入3H-TdR,，收獲細(xì)胞測定cpm值；以標(biāo)準(zhǔn)品cpm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出IL-4活性,。
（3）注意事項(xiàng)
1）B細(xì)胞純度直接影響結(jié)果，B細(xì)胞懸液中若含有T細(xì)胞或死亡T細(xì)胞及其碎片,，可影響試驗(yàn)結(jié)果,。因此有人主張用Percoll不連續(xù)密度梯度離心，去除死細(xì)胞及碎片,，可得到較高純度的B細(xì)胞懸液,。
2）純化B細(xì)胞懸液時(shí)，應(yīng)盡量縮短操作時(shí)間,，減少不利因素,，保證細(xì)胞活力,，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好,。
3）誘生細(xì)胞上清收獲時(shí)間必須控制在30h左右,。時(shí)間過長，上清中IL-4含量會降低,。