技術(shù)文章
氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的定性鑒定
閱讀:760 發(fā)布時(shí)間:2012-6-2一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
(1)學(xué)習(xí)一種鑒定氨基轉(zhuǎn)移作用的簡便方法及其原理,;
(2)進(jìn)一步掌握紙層析的原理和操作技術(shù),;
(3)了解氨基轉(zhuǎn)移作用在中間代謝中的意義,。
二、實(shí)驗(yàn)原理
氨基移換酶也稱轉(zhuǎn)氨酶,,它能催化α-氨基酸的氨基與α-酮酸的α-酮基互換,,這種作用稱為氨基移換作用。它在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與分解等中間代謝中,,在糖,、脂肪、蛋白質(zhì)三類物質(zhì)代謝的相互,、相互轉(zhuǎn)化上,,都起著很重要的作用。任何一種氨基酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨作用時(shí),,都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化,。它們的zui適pH接近7.4。在各種轉(zhuǎn)氨酶中,,以谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱谷草轉(zhuǎn)氨酶,、GOT)及谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶、GPT)活力zui強(qiáng),。
三,、試劑與器材
解剖器具、離心機(jī),、恒溫水浴,、干燥箱、臺(tái)秤,、層析系統(tǒng)等,。
1/15mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)、1%谷氨酸溶液(用KOH中和至中性),、1%丙酮酸溶液(用KOH中和至中性),、0.1%碳酸氫鉀溶液、0.05%碘乙酸溶液,、15%三氯醋酸溶液,、標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸溶液(0.1%)、標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸溶液(0.1%),、0.1%水合茚三酮乙醇溶液,、酚溶劑,。
四、操作方法
將兔擊暈,,迅速解剖,,取出肝臟,在低溫條件下剪碎,。稱取勻漿后,,離心取上清液,即為制備的酶液,。體外氨基移換反應(yīng),。紙上層析法檢查每人4個(gè)點(diǎn)(標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸溶液、標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸溶液,、對(duì)照上清液,、樣品上清液)。點(diǎn)樣放入層析罩內(nèi),。用被酚所飽和的水溶液,,平衡后,用帶小漏斗的玻璃管從層析罩上加飽合酚試劑25ml于層析缸內(nèi),。然后,,立即蓋緊塞子,當(dāng)溶劑前沿達(dá)到距濾紙上端約2.5cm處,,取出濾紙,,晾干或吹干,以除去酚溶劑,,噴灑0.1%茚三酮乙醇溶液,,放入烘箱中顯色氨基酸與茚三酮反應(yīng),在濾紙上呈現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn),。
五,、關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)
①取動(dòng)物新鮮組織制備酶液,防止酶失活,。
② 加碘乙酸抑制酶解作用,。