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抗體捕捉生物測定法檢測IL—12

閱讀:484          發(fā)布時間:2012-5-5

IL-12由B細胞產(chǎn)生,,由分子量分別為35kD和40kD兩個亞基通過二硫鍵連接而成,其功能為誘導T細胞,、NK細胞產(chǎn)生IFN-7,;增強T細胞、NK細胞的細胞毒作用,,促進激活的T細胞,、NK細胞增殖。
利用鼠抗人IL-12McAb(可自Roche公司購得)測IL-12濃度,。
1.用包被緩沖液(pH9.5的碳酸鈉緩沖液)稀釋包被抗體為15ug/mL,,在96孔酶標反應板,每孔加100rtl,,室溫包被過夜,。
2.洗滌后加封閉液(含1%BSA的磷酸鹽緩沖液)每孑L 2001uL,,37℃1h。
3.在試管中稀釋IL-12標準品為1ng/mL,,然后作5倍系列稀釋至8pe/mL(3管),。
4.待測樣品用*培養(yǎng)液作5倍系列稀釋3—5個稀釋度。
5.酶標板洗滌后,,分別加各稀釋度Ibl2標準品及待檢標本,,每孔100uL,每一標本設3復孔,,加100~L*培養(yǎng)液,,室溫孵育2.5—3ho
6.洗5次后,加PHA激活的人淋巴母細胞懸液(終濃度為2X104/mL)100uL/孔,,C02溫箱培養(yǎng)24h,。
7.加3H-TdR,以下步驟同IL-2測定,。根據(jù)標準曲線計算IL-12水平,。
8.注意事項 應盡量使待測樣品孔的3H-TdR摻人率位于標準曲線的陡峭部分,這樣所得結(jié)果才準確,。此外,,由于IL-12分泌細胞中有40kD多肽的過量表達,而40kD多肽無IL-12的生物活性,,故并非所有的抗IL-12抗體均適用于本法,。
 

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