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真核細(xì)胞基因組提取
閱讀:730 發(fā)布時間:2012-3-24一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?br />高等動物,,高等植物的基因組相當(dāng)龐大, 如人類細(xì)胞基因組由30億個堿基對組成,果蠅基因組有1.4×108個堿基對,,水稻基因組有1.4×109個堿基對,。真核細(xì)胞基因組中,約1萬-1.5萬個可表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因,,其它大量存在的是調(diào)控序列和內(nèi)含子序列,。可以說某特定物種的基因組,,包含了該物種生長,,發(fā)育,繁殖等各項(xiàng)生理活動的幾乎全部信息量,,因而對真核細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu),,組成,以及表達(dá)調(diào)控的研究是至關(guān)重要的,,而研究的起點(diǎn)就是要獲得純度高--不含蛋白質(zhì),、糖類、酚,、氯仿等污染,;得率好--以便有足夠量用于分析;基因組相對完整--斷裂的基因組以便用于以后PCR分析,,RFLP分析,,基因文庫的構(gòu)建,基因探測等的研究,。
真核細(xì)胞基因組在提取過程中一般有以下幾步,,首先是機(jī)械法破細(xì)胞抽提;然后去除蛋白質(zhì),,糖類等細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)污染,;zui后純化出DNA,由于真核細(xì)胞基因組較大,,在操作中應(yīng)注意動作輕柔,,且在低溫下進(jìn)行,以zui大限度地減少機(jī)械和化學(xué)作用對DNA的剪切,,從而獲得相對完整的DNA,。
二.實(shí)驗(yàn)試劑及材料
材料:幼嫩的植物材料0.5g左右。
試劑:液氮
CTAB抽提緩沖液:2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide,, 十六烷基*基溴化銨) ,,1%β-巰基乙醇 1.4mol/L Nacl,20mmol/L EDTA,,100mmol/L Tris-Hcl pH8.0
3M NaAC
50mM Tris-HCl pH8.0
20mM EDTA
氯仿:異戊醇(24:1)
異丙醇 70%乙醇TE buffer
三.實(shí)驗(yàn)方法
1.取0.5g植物材料,,雙蒸水洗凈,,并用濾紙吸干。
2.植物材料剪成1cm左右碎片,,放入預(yù)冷的瓷研缽中,。
3.加入液氮速冷,研磨成細(xì)粉(越細(xì)越好),。
4.在5ml離心管中加入抽提緩沖液2.5ml,,60℃保溫1小時。
5. 15000rpm,,離心10分鐘,。上清轉(zhuǎn)入另一個新的離心管中。
6.加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),,混勻抽提至水乳膠融狀,。
7. 15000rpm,離心10分鐘,。
8.上清轉(zhuǎn)入另一個新的離心管中。
9.加入2/3倍體積預(yù)冷異丙醇,,-20℃保溫30min―1hr,,緩緩混勻DNA成絮狀折出。
10.15000rpm,,離心10分鐘,,棄上清。
11.DNA沉淀用 70%乙醇洗2次,。
12.加入400μl TE buffer溶解DNA,。