技術(shù)文章
RA33抗體檢測方法
閱讀:465 發(fā)布時(shí)間:2011-9-21免疫熒光法不是檢測該類自身抗體的合適方法,,因常出現(xiàn)陰性結(jié)果,即使存在價(jià)的hnRNP A2/RA33抗體,也不能顯示出特征性核著染圖形,。此外因該抗體不形成沉淀物,故而免疫擴(kuò)散方法也不適用,。
以半純化的hnRNP A/B為抗原的蛋白質(zhì)印跡法是*的檢測方法,。核提取物不純時(shí)也可應(yīng)用,但在鑒別蛋白條帶時(shí)可能會(huì)遇到困難,,特別是SLE患者的血清,。可用肝素瓊脂糖層析法獲得hnRNP制劑,,進(jìn)行12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,,轉(zhuǎn)印在硝酸纖維素膜上。血清用含3%的脫脂奶粉的20mm01/LTris-HCl或pH7.4磷酸鹽緩沖液做1:25稀釋,,與膜上抗原一起孵育40min,。在孵育液中應(yīng)避免含有去垢劑諸如TritonX-lOO或Tween20,因?yàn)閾?jù)推測去垢劑將導(dǎo)致SLE血清的DNA-抗DNA免疫復(fù)合物的非特異性結(jié)合引起假陽性的結(jié)果,。推薦在免疫檢測中應(yīng)用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG抗體,,原因是某些過氧化物酶標(biāo)記的抗體可引起非特異性的染色,,尤其是在hnRNP-A2帶。因?yàn)樵赟DS凝膠中蛋白移行成雙聯(lián)體,,所以抗hnRNP-A1染色在大約33/34kD處可出現(xiàn)雙帶,。抗hnRNP-A2/:RA33在大約36kD處染色成一帶,,除此之外在37鄺8kD處相應(yīng)于hnRNP-B1/B2也有雙聯(lián)體,。這些染色特征的出現(xiàn)被認(rèn)為可以更好的解釋蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。
采用高純度的天然hnRNP-A2的E1.ISA較蛋白質(zhì):印跡法的靈敏度為高,,特別是在檢測SLE和MCTD患者的血清方面,。但是ELISA和蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果有時(shí)不一致,可能是因?yàn)楸┞犊乖瓫Q定簇的不同或者是識別了不同的抗原表位和(或)抗原的溶解度低有關(guān),。