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大鼠RAGE ELISA KiT
閱讀：600 發(fā)布時間：2011-7-5產(chǎn)品編號：EIA05519
使用前*閱讀說明書,。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于經(jīng)典酶聯(lián)夾心技術(shù)原理,，能測量大鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE），只能用于研究用途,，不得用于醫(yī)學(xué)診斷,。
工作原理
晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products,RAGE）是細胞表面分子免疫球蛋白超家族成員之一,屬多配體受體,其通過與細胞表面不同配體結(jié)合發(fā)揮效應(yīng),廣泛研究表明：RAGE參與糖脂代謝、細胞增殖與分化,、炎癥反應(yīng)等生理病理過程,。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（ELISA）。預(yù)先包被的抗體為多克隆抗體,。檢測相抗體也為多克隆抗體,，經(jīng)生物素（biotin）標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后,，PBS或TBS洗滌,。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關(guān),。
每套試劑盒中內(nèi)容（96T）
材料 數(shù)量
標(biāo)準品 2vial
預(yù)包被抗體的96孔板 96T （ 8×12）
生物素標(biāo)記抗體 96T （1:100）
ABC（過氧化物酶標(biāo)記親和素） 96T （1:100）
樣品稀釋液 96T
抗體稀釋液 96T
ABC稀釋液 96T
TMB顯色液A 96T
TMB顯色液B 96T
TMB終止液 96T
ELISA洗滌液 96T（1:25）
需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱,。
2． 標(biāo)準規(guī)格酶標(biāo)儀。
3． 自動洗板機,。
4． 單通道或多通道可調(diào)節(jié)移液器以及其吸頭,。
5． 蒸餾水，容量瓶等
6． 干凈的試管和Eppendof管。
注意事項
1． 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘,。
2． 配制各種試劑時，切記混勻,！
3． 用戶在初次使用試劑盒時,，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底,。
4． 建議所有標(biāo)準品,、樣本都做雙份檢測。
5． 要嚴格避免操作過程中酶標(biāo)板干燥,。干燥會使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活,！
6． 為免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管,。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
樣品的準備和保存
樣品如果不立即分析,，應(yīng)分裝后冷凍保存，且避免反復(fù)凍融,。
血清——用干凈試管收集血液,，室溫凝固2小時或4℃過夜，離心1000×g 10分鐘,，收集血清,。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
細胞培養(yǎng),、組織勻漿,、體液——離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存,。
樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱文獻了解標(biāo)本內(nèi)待測因子的含量,，決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測范圍,。樣品的稀釋應(yīng)有詳細記錄,。
試劑的準備和保存
A. 標(biāo)準品的稀釋和使用：在使用前2小時內(nèi)準備。將凍干品管內(nèi)加入1ml樣品稀釋液，*溶解后做倍比稀釋,。
稀釋后的標(biāo)準品在2小時內(nèi)使用,。
B．生物素標(biāo)記抗體工作液：在使用前2小時內(nèi)準備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml）,。
2． 按10ul生物素標(biāo)記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液,。輕輕混勻。
C．親和素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內(nèi)準備,。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量（實配時應(yīng)多配制0.1-0.2ml）,。
2． 按10ul親和素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻,。
D. TMB顯色工作液的準備：在使用之前30分鐘,，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液。
操作程序
1． 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目,。
2． 將倍比稀釋的標(biāo)準品各0.1ml依次加入一排7孔中,，1孔只加樣品稀釋液的作為對照。處理后的標(biāo)本按100ul每孔加入,。
3． 酶標(biāo)板加上蓋,，37℃反應(yīng)90分鐘。
4． 反應(yīng)后用自動洗板機吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；或甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體,，再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次,。
5． 將準備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入,。37℃反應(yīng)60分鐘。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次,，每次浸泡1分鐘左右,。
7． 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)30分鐘,。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次,，每次浸泡1-2分鐘左右。
9． 按每孔0.09ml依次加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液,，37℃避光反應(yīng),，反應(yīng)過程中，要經(jīng)常的觀察,，當(dāng)肉眼可見標(biāo)準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔差別不明顯時，即可加入TMB終止液0.1ml/孔,。（顯色反應(yīng)zui長不要超過30分鐘）,。
10． 用酶標(biāo)儀在450nm測定O.D.值,。
11． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算,。應(yīng)記住由于樣品稀釋了N倍,，其實際濃度應(yīng)該×N。
操作程序總結(jié)：
準備試劑,，樣品和標(biāo)準品
加入準備好的樣品和標(biāo)準品,，37℃反應(yīng)90分鐘
洗板2次，加入生物素化抗體工作液,，37℃反應(yīng)60分鐘
洗板3次，加入ABC工作液,，37℃反應(yīng)30分鐘
洗板5次,，加入TMB顯色液，37℃反應(yīng)
加入TMB終止液
30分鐘之內(nèi)讀OD值
計算標(biāo)本待測因子含量
檢測范圍：10000pg/ml→156pg/ml,。
敏感性： ＜10pg/ml
特異性： 系統(tǒng)和其它細胞因子無交叉反應(yīng),。
保存： -20℃ [短期內(nèi)（如兩周）可4℃]
有效期： 12個月（-20℃）。
用途： 用于體外定量分析液體標(biāo)本（通用型）,。
REFERENCES
1． Radice G L, Rayburn H, Matsunami H, et al, Developmental defects in mouse embryos lacking N-cadherin. Dev Biol, 1997, 181: 64-78
2． Horikawa K, Radice G, Takeichi M, et al. Adhesive subdivisions intrinsic to the epithelial somites. Dev Biol, 1999, 215: 182-189
3． George E, Georges-Labouesse E N, Pa-King R S, et al. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development, 1993, 119: 1079-1091
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