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熒光顯微鏡的原理部件及激發(fā)方式
閱讀：772 發(fā)布時間：2011-5-27熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同,，它不是通過普通光源的照明觀察標本,，而是利用一定波長的光（通常是紫外光,、藍紫光）激發(fā)顯微鏡下標本內(nèi)的熒光物質(zhì),，使之發(fā)射熒光,，所以，熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明,，而是作為一種激發(fā)標本的內(nèi)熒光物質(zhì)的能源,。我們之所以能觀察標本，是由于光源的照明,，而是標本內(nèi)熒光物質(zhì)吸收激發(fā)的光能后所呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象,。
由此可知，熒光顯微鏡的特點,，主要是它的光源能供給大量特定波長范圍的激發(fā)光,，使受檢標本內(nèi)的熒光物質(zhì)能獲得必要強度的激發(fā)光。同時,，熒光顯微鏡必須具備相應(yīng)的濾光鏡系統(tǒng),。
熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具,。它是由超高壓光源、濾片系統(tǒng)（包括激發(fā)和壓制濾板）,、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成（圖3—12）,，是利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光。
激發(fā)熒光的方式：按光的波長范圍分為UV激發(fā)法（使用紫外線照明法）和BV激發(fā)法（使用藍紫光）兩種,。UV激發(fā)法是用短于400nm的近紫外光進行激發(fā),。該法不存在可見的激發(fā)光，所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光,，容易判別標本上的特異熒光和背景組織的自身熒光,。
BV激發(fā)法是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍光進行激發(fā),。該方法使用藍光照射標本,，所以熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用可*阻斷藍光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片,。用于熒光抗體法的熒光色素,。對于激發(fā)光的極大吸收波長和熒光的極大發(fā)光波長比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片,。該法可用藍光作為激發(fā)光,，所以熒光色素的吸收效率較高，可得到較明亮的圖像,。其缺點是500nm以下的熒光無法看到,，而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在熒光抗體法中,，大多以熒光色素*的顏色來判斷其特異性,，所以在討論微妙的特異性時，上述BV激發(fā)法的缺點往往影響極大,。
綜上所述,，熒光顯微鏡的照明可根據(jù)聚光器的構(gòu)造和激發(fā)光的波長按以下三點考慮。
①從熒光像的反差要求來看,，UV激發(fā)暗場聚光器照明,。
②以像的亮度來考慮,，BV激發(fā)濾光片暗場觀察效率zui高,。
③UV激發(fā)濾光片暗場觀察和BV激發(fā)暗場聚光器照明的特性，可看作介于這兩種照明方法之間,，但前者濾光片暗場的性質(zhì)較強,，顯示圖像較明亮，反差??；后者因保留暗場光路的性質(zhì),，故顯示圖像較暗，而反差有所改善,。當實際使用熒光顯微鏡時,，應(yīng)采用標本要求的照明法進行觀察。
必須指出,，即使像反差*的UV激發(fā)暗場聚光器照明,，由標本折射或散射的部分紫外激發(fā)光也會進入物鏡，這樣在光學(xué)系統(tǒng)中的加拿大膠膠合面和光學(xué)玻璃因激發(fā)引起的自身熒光會使像的反應(yīng)變壞,。因此,，必須在目鏡前面使用紫外吸收濾光片作為截止濾光片。