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石蠟組織切片的制備
閱讀：1156 發(fā)布時間：2011-3-24當(dāng)尋找適用的方法時,，請注意下述資料是10多年經(jīng)驗的結(jié)晶,。
制備1升Bouin固定液：2g苦味酸溶于500ml去離子水中,，濾過，在通風(fēng)櫥中,，加入20g多聚甲醛,，加熱至60℃,，加數(shù)滴lmol／LNaOH使其溶解；冷卻,，加500ml 2xPBS,。
大多數(shù)的組織學(xué)研究都采用多聚甲醛固定、石蠟包埋的組織標(biāo)本,。因此,，此類來源的大多數(shù)的組織和器官，對抗原的定位可直接提供可靠的資料,。組織學(xué)家和病理學(xué)家有豐富的組織學(xué)經(jīng)驗,，并且，對抗原表達模式的評價是很有價值的,。
如果固定和包埋過程粗糙,，則許多抗原不能被很好地保存。固定的持續(xù)時間是一個很重要的可變因素,，因為延長固定時間會降低抗體反應(yīng)能力,。在病理學(xué)實驗室，固定的持續(xù)時間和其他細(xì)節(jié)也很少規(guī)范化,。因為固定液對組織的穿透率在特定溫度下是恒定的（大約室溫下imm／h）,，所以，不可能將所有樣品用相同的方式固定,。因免疫染色的目的不同,，固定方法應(yīng)各異。理想的設(shè)計是研究者能夠?qū)?biāo)本的收集,、固定專門化,，在研究中優(yōu)化設(shè)計,，從而能夠更好地證實抗原,。
避免使用含有汞的固定液。
1．準(zhǔn)備工作
石蠟組織塊可以事先準(zhǔn)備,，切片可以在步驟5中完成,。許多病理學(xué)或其他相關(guān)實驗室有大量貯存的研究材料。
2．需要的溶液和特殊設(shè)備
4％多聚甲醛（新鮮配制,，見附錄Ⅳ）或Bouin固定液,，詳見步驟2；
二甲苯,、100％乙醇和95％乙醇,；
切片機，石蠟包埋設(shè)備,。
3．操作步驟
（1）將組織切成小塊約lcm×lcm×0．4cm,。
Methocarn是甲醇：氯仿：冰乙酸按6：3：1的比例配制的混合物,。當(dāng)使用Methocarn時，切片的*步必須使用無水乙醇,。
（2）將組織塊放入固定液中,，如果標(biāo)本制備專為進行免疫化學(xué)定位研究，包括直接染色或者對比染色,、復(fù)染,，建議使用新鮮配制的4％多聚甲醛。然而,，標(biāo)準(zhǔn)的病理學(xué)方法可以有效地使用任何一種廣泛適用的固定液,，包括Bouin液或Methocarn。
固定液穿透組織大約每小時imm,?？梢杂纱斯烙嬇卸ㄋ枰墓潭〞r間。
（3）標(biāo)本孵育2h至過夜,。
（4）標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋過程和組織切片,。
（5）收集4um切片，粘于干凈的載玻片上,。
石蠟組織塊在步驟4?？少A存，供以后檢測,。石蠟組織塊較穩(wěn)定,，可以使用多年。
（6）標(biāo)本片于37℃孵育過夜,。
高溫（步驟6）常常在許多組織化學(xué)過程中被采用,，但是常會引起許多抗原表位的缺失，所以應(yīng)盡可能避免,。
（7）切片用二甲苯脫蠟,，換2次，每次3min,。
（8）用系列乙醇水化（100％乙醇,，換2次，每次3min,；95％乙醇,，換2次，每次3min,。
（9）用水漂洗,。
由于固定、包埋和準(zhǔn)備條件粗糙,，石蠟包埋組織切片的染色常要求敏感的檢測方法和應(yīng)用多步驟放大效應(yīng)技術(shù),。
此時,，標(biāo)本可進行抗體染色
4．常見的問題
如果使用過氧化物酶或者堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測方法，在加入抗體前如果需要阻斷內(nèi)源性酶的活性,，則標(biāo)本應(yīng)該先阻斷或抑制內(nèi)源性酶的活性,。由于阻斷過程也許會損傷一些抗原，所以不如改用檢測試劑,。
阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,，使用甲醇：3％過氧化氫（按4：1的比例配制）溶液孵育標(biāo)本20min。過氧化氫一般以30％的溶液貯存于4℃,，可以存放1個月,。有些標(biāo)本如睥或骨髓具有較高過氧化氫酶活性，則采用0．1％鹽酸苯肼／PBS溶液會取得較好的效果,。盡管有些資料建議單純使用3％過氧化氫處理標(biāo)本,，但是不應(yīng)該這樣做，因為劇烈的反應(yīng)和氣泡的形成可以破壞標(biāo)本,。
阻斷內(nèi)源性堿性磷酸酶活性,，則用0．1 mm01／L左旋咪唑溶液孵育。此抑制劑不能減少腸組織的堿性磷酸酶活性,。因此,，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體不宜用于有內(nèi)源性腸堿性磷酸酶的標(biāo)本染色。