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果蠅類標本發(fā)育晚期胚胎的制備
閱讀：614 發(fā)布時間：2011-3-24 1．所需溶液和特殊設備
漂白劑,；庚烷,；含3．7％甲醛的2mmol／L PIPES（pI-17．0）；甲醇,；PBS,。
解剖顯微鏡；探頭式超聲發(fā)生器,。
2．操作步驟
EGTA,，1mm01／L硫酸鎂，100 mmol／L （1）在盛有蘋果汁或葡萄汁的平皿內(nèi)采集胚胎,，用水漂洗,。
大多數(shù)果蠅專家習慣于在尼龍網(wǎng)濾器上漂洗胚胎標本。
（2）將胚胎轉(zhuǎn)入50m1三角燒瓶或類似的玻璃容器中,，以便搖動時不會溢出,。加25ml 50％漂白劑以去除絨毛膜。偶爾攪動,，3min后,，用水洗數(shù)次，*洗凈,。用解剖顯微鏡觀察胚胎,。如果絨毛膜未*去除，重復漂白處理,。
（3）通過吸出,，盡可能去除大部分水。加10ml庚烷并攪動兩次,。然后加10ml含3．7％甲醛的2mmol／LEGTA,、1mm01／L硫酸鎂、100mm01／LPIPES（pH7．0）,。輕輕混合10～60min,，使其混勻,。庚烷將在卵黃膜上打一些小孔，以便甲醛透過并固定胚胎,。將要孵出的胚胎已經(jīng)去除其卵黃膜,，進入水相的底部。而帶有卵黃膜的胚胎將仍處在庚烷／水相的界面,。
串熔／固宋演作用時間的長短取決于所研究的特定抗原抗體復合物,。去除胚胎的時間分別為5，10,，20和40min,，從中尋求一個*的時間。
（4）停止搖動,，使各液相分開,。通過吸出，盡可能去除大部分水相（底部）,，不要碰到存在于甲醛和有機溶劑／水相界面的胚胎,。
可將胚胎轉(zhuǎn)入塑料管中，在甲醇中—20C下可保存數(shù)年,。
（5）加10ml甲醇,。劇烈搖動60s。仍貼在胚胎上的卵黃膜落入甲醇相（底部）,，將在其中膨脹,。
（6）去除庚烷及盡可能大部分甲醇。用甲醇洗胚胎3次,，每次5min以上,，并搖動，以去除殘余的庚烷,。
（7）用PBS洗胚胎3次,，每次5rain以上。
（8）將胚胎轉(zhuǎn)至小離心管中,。去除PBS,，并加入500t~lPBS,，其中胚胎的體積僅占100ul,。為了粉碎角質(zhì)膜，用探頭式超聲發(fā)生器處理2—3s,，能量輸出設置zui低,，觀察胚胎并掌握好超聲處理的時間，不應該使過多的胚胎發(fā)生形態(tài)學損傷,。超聲處理一個循環(huán)后大部分抗體便可溶出,，但也可使用多輪循環(huán),，直至一些胚胎剛好出現(xiàn)損傷為止。多輪循環(huán)之間,，將試管放在冰上,，以使溫度降至zui低。
（9）用PBS洗胚胎3次,，每次5min以上,。
至此，已制備好的胚胎可加入一抗和用酶標二級試劑進行染色,，或用熒光素標記的二級試劑染色,。