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儀器用具：

37℃培養(yǎng)箱及冰浴

Electroporation cuvette （electrode gap, 0.1 cm）

Electroporator （Bio-Rad, IBI geneZapper 或其它廠牌）

 

藥品試劑：

無(wú)菌水 （置冰浴中）

10% glycerol （置冰浴中）

SOB 液體培養(yǎng)基

SOB 固體培養(yǎng)基

SOC 液體培養(yǎng)基

SOC/Amp 固體培養(yǎng)基

大腸桿菌JM109

Ligation mixtures

 

方法步驟：

菌體的處理：

1） 進(jìn)行轉(zhuǎn)形實(shí)驗(yàn)的前16~20 h，將菌種JM109 接種在SOB 固體培養(yǎng)基上,，并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

34 Methods in Biotechnology Vol 1

2） 取80 mL SOB培養(yǎng)基裝入250 mL滅過(guò)菌的三角瓶。 另取1 mL SOB加于微量離心管中,。由SOB固體培養(yǎng)基上選8 個(gè)約2~3 mm大小的單一菌落接入1mL SOB中,，震蕩將菌體打散后,，加入80 mL SOB中，于37℃震蕩培養(yǎng)約2~3h,，直至細(xì)胞數(shù)約為4~7×107/mL,。

3） 收集菌液于離心管中，置冰浴中10 min,。

4） 以750~1,000 g 離心12~15 min （4℃）,。

5） 倒去上清，并盡量將液體倒干,，或以微量移液器頭吸干凈,。

6） 沉淀加入80 mL 冰冷的無(wú)菌水，稍加震蕩,，混合均勻后以750~1,000 g 離心12~15 min （4℃）,。

7） 倒去上清，菌體再依序以40 mL 及1.6 mL 無(wú)菌水同法處理,。

8） 菌體以0.16 mL 冰冷的10% glycerol 懸濁,。

9） 菌液每80 μL分裝一管，可直接用于electroporation,，或以液態(tài)氮或干冰快速凍結(jié)后置 -70℃貯存,。

Electroporation：

1） 進(jìn)行electroporation 的DNA 樣品溶液中離子強(qiáng)度不可過(guò)高，DNA 需先經(jīng)過(guò)透析或以酒精沉淀處理,。透析可如2.3.1 節(jié)步驟15） 進(jìn)行,。

2） Cuvettes 自包裝中取出后，置冰浴中至少5 min,。

3） 將菌液置于冰浴中,，加入DNA 樣品，混合后,，小心將溶液吸至cuvette 的凹槽中,，將cuvette 置冰浴中。

4） 進(jìn)行electroporation 時(shí),，將cuvette 由冰浴中取出,，將四周水份擦干,，置于反應(yīng)槽中,，并接上電極線。

5） 以2.5 kV, 21 μF 進(jìn)行electroporation,。

◆ 注意,！高電壓！

6） 取出cuvette,，立即加入1 mL SOC,。

7） 吸出菌液移至微量離心管中,，于37℃震蕩培養(yǎng)45 min。

8） 取200 μL 菌液涂布于SOC/Amp plate,。置37℃培養(yǎng)16~20 h,。

9） 觀察plate 上菌落的形狀并計(jì)算菌落數(shù)。