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DNA為基礎(chǔ)的方法檢測飼料中的動物源性
閱讀：577 發(fā)布時間：2011-1-8以檢測DNA為基礎(chǔ)的方法主要有核酸探針雜交,、DNA指紋分析、PCR-RFLP分析,、PCR特異擴增（常規(guī)PCR方法和Real-time PCR方法）,。其主要原理都是對各物種內(nèi)特異的核酸序列進行提取、鑒定,，從而判定飼料內(nèi)有無該物種的成分,，只是結(jié)果判別的信號條件不同。
核酸探針雜交方法的原理是堿基配對,，即一條DNA鏈能與它的特異互補鏈配對形成雙鏈DNA,。因此，用一個熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)標記的單鏈核苷酸探針能夠很快地從許多其他DNA分子的混合物中檢測出它的互補單鏈,。由于雜交探針需要用熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)進行標記,，所以該法在實際檢測中很少應(yīng)用,。
動物基因組中存在大量的分散重復(fù)序列（interspersedrepeat sequence，IRS）,，并且是種間高度特異的,，DNA指紋分析就是通過用哺乳動物中廣泛存在的分散重復(fù)序列的特異引物進行PCR擴增，建立從牛到鴕鳥的30多種哺乳動物的DNA指紋圖譜,，來對飼料中的動物源性成分的DNA進行鑒定,。由于DNA指紋有一定難度，所以該法在實際檢測中也較少應(yīng)用,。
PCRRFLP（限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析）方法是用引物進行擴增,，然后對擴增片段用限制性內(nèi)切進行酶切，利用限制性內(nèi)切酶的多態(tài)性進行檢測,。由于使用的限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶切分析不方便,，所以該法在實際檢測中應(yīng)用較少。
PCR特異擴增方法由于其簡單,、快速,、特異性強成為目前zui廣泛應(yīng)用的方法，特別是熒光PCR（或稱為Real-timePCR）的應(yīng)用使得檢測的特異性和敏感性更高,。Tartaglia*次設(shè)計了PCR試驗,，將其用于肉骨粉以及飼料中的反芻動物源性成分的檢測。他所選的目標片斷是線粒體DNA中編碼tRNAlys和ATP合成酶8亞基和6亞基的片段,，高等植物中未發(fā)現(xiàn)其同源序列,，采用異硫氰酸胍和二氧化硅方法提取DNA，肉骨粉的檢出的含量的zui低限為0．125％,，我國的出入境檢驗檢疫系統(tǒng)根據(jù)該方法制定了檢測肉骨粉中牛源性,、羊源性成分的行業(yè)標準,。
但是,，隨后對PCR方法的驗證發(fā)現(xiàn)這一方法有其缺陷，因為加工過程中的熱處理使得大量DNA被嚴重降解,，分解成小片段,，有數(shù)據(jù)表明當(dāng)肉被加熱到100~C時，其中的DNA就被降解到1100bp至300bp左右,。若設(shè)計的目的片段太長則可能無法擴增出來,，這在許多人的報道中被證實。因此,，需要設(shè)計比較小的目的片段,，同時要選擇細胞內(nèi)含量比較多的目標片段。目前所建立的PCR方法中以線粒體DNA中的細胞色素b與tRNAlysATP合成酶亞基8和亞基6的片段為目標區(qū)域的較多,，線粒體基因的其他部分（如D—loop區(qū)域）,，還有其他核酸序列（如衛(wèi)星DNA,、actln基因、SINEs序列和LINEs序列,、生長素基因等）也被作為檢測的目的基因,。
線粒體編碼的長度為60-70bp的片段已經(jīng)被作為一些物種的目標片段進行檢測，由于這些片段比較小,，用瓊脂糖電泳檢測非常不方便,，但用熒光PCR檢測可以避免這些問題。Real—tmmPCR中使用的TaqMan技術(shù)是在引物的基礎(chǔ)上又添加了一條探針,，只有在探針與擴增出的目標片段結(jié)合時,，才發(fā)出熒光信號，可以根據(jù)發(fā)出的熒光對反應(yīng)進行實時檢測,，比經(jīng)典的PCR方法特異性高,，這是因為有引物和探針對目標進行雙重篩選。有資料表明用這項技術(shù)對幾種動物成分進行了檢測,，在所有樣品中動物的成分都可清楚地檢測到,，這一結(jié)果說明，肉骨粉經(jīng)過加工后,，即使溫度達到141~C,，也有足夠的DNA可通過Real—time PCR技術(shù)檢測到，而當(dāng)目標片段設(shè)計為275bp或350bp時,，所有的樣品都檢測不到,。同時對于目前的定性檢測，利用不同的探針和染料可以做到一個反應(yīng)內(nèi)檢測多個動物品種,。
PCR方法在檢測大多數(shù)生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的飼料,，至少在歐盟法定的條件下生產(chǎn)的肉骨粉是有效的，但生產(chǎn)過程的多樣性導(dǎo)致了基因物質(zhì)的不同降解水平,，因此不同的生產(chǎn)條件都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響,，擴增的片段大小也會對檢測的靈敏度產(chǎn)生影響。PCR的缺點還表現(xiàn)在必須的刻防止交叉污染,，并且這個方法無法檢測動物DNA的來源,，因為肉骨粉的出現(xiàn)與陽性信號的出現(xiàn)并無直接關(guān)系，乳汁,、血液,、脂肪都有可能是DNA的來源。PCR方法相對來說是一種比較昂貴的方法,，不僅試劑貴而且也需要比較昂貴的儀器,，特別是熒光PCR儀。