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恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留檢驗的液相色譜法
閱讀：1069 發(fā)布時間：2011-1-8 （1）試劑和材料 以下所用的試劑,，除特別注明外均為分析純試劑，水為符合GB／T6682規(guī)定的二級水,。
①環(huán)丙沙星 含環(huán)丙沙星不得少于99．0％
②恩諾沙星 含環(huán)丙沙星不得少于99．0％
③乙腈：色譜純
④三乙胺
⑤氫氧化鈉
⑥磷酸二氫鉀
⑦磷酸
⑧5．0mot兒氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉飽和溶液14ml,，加水稀釋到100ml；
⑨0．03mot／L氫氧化鈉溶液：取5．0mol／L氫氧化鈉溶液o．6ml,，加水稀釋到100ml,。
⑩0．05mol／L磷酸／三乙胺溶液（pH 2．4）：取85％的磷酸3．4ml，加水稀釋到1000ml,，攪拌下滴加三乙胺,，調(diào)pH值至2．4。
⑾磷酸鹽緩沖液（用于肌肉,、脂肪組織）：取磷酸氫鉀6,，88，加水溶解并稀釋至500ral,，用lOmol兒氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0,。
⑿磷酸鹽緩沖液（用于肝臟、腎臟組織）：取磷酸氫鉀&8g,，加水溶解并稀釋至600ml,，調(diào)pH值為4．0～5．O。
⒀環(huán)丙沙星,、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備液：稱取環(huán)丙沙星,、恩諾沙星對照晶各50mg，用o．03mol／L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋成濃度為lmg／mI的貯備液,，置2～8℃冰箱中保存,，有效期為1個月。
⒁環(huán)丙沙星,、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取適量環(huán)丙沙星,、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備液,，用乙腈稀釋成適宜濃度的環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液,。
（2）儀器和設(shè)備
①液相色譜儀（配熒光檢測器）
②分析天平 感量0．0001g
③天平 感量O．01g
④渦旋振蕩混合器
⑤組織勻漿器
⑥離心管 25m1,、
⑦固相萃取裝置
⑧離心機(jī)
⑨C18固相萃取柱
（3）測定步驟
①提取 稱取（2i 0．05）z試料,，置于30ml勻漿杯中,，加磷酸鹽緩沖液10．0ml，1]0000r／min勻漿llnin,。勻漿液轉(zhuǎn)入50ml離心管中,，振蕩混合5min,，4000r／min離心10rain,，上清液轉(zhuǎn)入另一25ml離心管中。用磷酸鹽緩沖液10．0mi洗刀頭及勻漿杯,，轉(zhuǎn)入50ml離心管洗殘渣,，攪勻，振蕩,，離心,。合并上清液于25ml離心管中，備用,。
②凈化 Cis固相萃取柱依次用2ml甲醇,、2ml潤洗，潤洗完畢后,，準(zhǔn)確量取適量備用液過柱,，用2ml水洗，擠干,。加2．0ml流動相洗脫,，擠干。收集洗脫液作為試樣溶液,，供液相色譜分析,。
③標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確量取適量環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液,，用流動相稀釋成濃度為0．002ug／ml,，0．005ug／m1，0．01ug／ml,，0．05ug／m1,，0．10ug／m1，O．30ug／ml,，0.50ug／ml的環(huán)丙沙星,、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液,，供液相色譜分析。
④測定
a.色譜條件
色譜柱：C18 250mm×4．6mm（內(nèi)徑）,，粒徑5／tm,，或相當(dāng)者。
流動相：0．05mol／L磷酸溶液／三乙胺—乙腈（82+18）
流速：0．8mi／mid,。
檢測波長：激發(fā)波長280nm,；發(fā)射波長450nm
進(jìn)樣量：20uL。
b.測定 取適量試樣溶液和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,，作單點校準(zhǔn)或多點校準(zhǔn),，以色譜峰面積積分值定量。標(biāo)準(zhǔn)工作液及式樣液中的環(huán)丙沙星,、恩諾沙星響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi),。在上述色譜條件下，環(huán)丙沙星,、恩諾沙星的保留時間分別在11min和8min左右,。
⑤空白試驗 取空白試料，采用*相同的測定步驟進(jìn)行平行操作
（5）靈敏度和回收率
本方法在雞的肌肉,、脂肪,、肝臟和腎臟組織中的檢測限為環(huán)丙沙星20ug／kg、恩諾沙星在5～20ug／kg
在2～20ug/kg添加濃度水平上,，回收率范圍為79．27％～98．74％,。