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瘋牛病夾心酶聯(lián)免疫吸附測定方法
閱讀：716 發(fā)布時間：2011-1-4本方法（PLAIA ELISA）是一種快速、準確性高的瘋牛病篩選方法之一,，1999年通過歐盟認證,。該方法具有反應時間短、成本低,、反應步驟少的特點,。瘋牛病夾心ELISA是法國原子能委員會（FrenchAtomicEnergyCommission）研制出來的一種診斷瘋牛病的快速方法，現(xiàn)被美國Bio-Rad公司收購,。該方法又稱PLAIA~BSE試驗,，它由兩種試劑盒組成，即BSE純化試劑盒和BSE檢測試劑盒,。本方法的原理是用BSE純化試劑盒中的試劑和蛋白酶K對牛腦腦干部的朊毒體進行消化,、純化、濃縮和溶解,。BSE檢測試劑盒是用兩種單抗通過免疫酶技術(shù)對異常PrP進行檢測的試劑盒,，本試劑盒可檢測180個樣本。酶標板有12X8個孔,，每孔包被有一抗（PrP單抗）,，同時另一單抗標記了過氧化物酶。反應結(jié)束后用酶標儀讀數(shù),，測定樣本的OD值判定結(jié)果,。
本方法的耗時約為5h，特異性和敏感性均為100％,。
瘋牛病夾心ELISA檢測方法的主要步驟如下,。
（1）BSE病原純化 從腦閂部?。?50±40）mg神經(jīng)組織,。將樣品轉(zhuǎn)移到研磨管，用專配的細胞破碎儀勻漿一個循環(huán)45s,。當研磨不充分時,，可以多做1-2個循環(huán)，但注意在每個循環(huán)之間要保持管子的溫度在室溫或4~C,。取勻漿液500~L樣品轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中,。取500~L配好的PK酶溶液加到離心管中，混 勻并在（37土1）℃下水浴或恒溫箱內(nèi)孵育,。在離心管中加入500~L試劑B,，混勻直至均一的藍色。在室溫下20000g離心5min或15000g離心7rain,。棄去上清液,，然后用吸水紙吸干每一管。在每管中加入50t~L試劑CI， （100土1）℃下孵育（5i1）min,，然后在每管中加入250gL試劑R6,。
（2）BSE病原檢測 以下面的順序在各孔中加入相應溶液：A1、B1,、C1,、D1加入100ml+陰性對照液R3；E1,、P1加入100~L陽性對照液R4,；G1、H1等加入100uL已稀釋的樣品溶液,。蓋上密封膜在（37土1）℃下孵育（75土15）min,。洗完板后在每孔中加入100~L酶標一抗，蓋上密封膜并在2～8~C下孵育（60±5）min,。洗完板后在每孔中加入100~L顯色液并在室溫下暗處孵育30min,。與加顯色液的順利一致在每孔中依次加入100pL終止液。在終止反應后擦干酶標板的底部,，在30min內(nèi)用測量值為450nm,，參考值為620nm處讀數(shù)，得到各孔的OD值,。
（3）結(jié)果分析 當有一個陰性對照的OD值在正常范圍之外或超出OD平均值的40％,，則該值視為脫離正軌的值，要淘汰,，然后重新計算其他三個陰性對照的OD平均值,，將此值作為本實驗的CUT-OFF值。如果有兩個或更多的陰性對照OD值在正常范圍之外或超出OD平均值的40％,，則重做實驗,。陽性對照的OD值必須大于或等于1．0。
若樣品的OD值小于CUT-OFF值則樣品視為陰性,。當然,，如果樣品的OD值剛剛低于CUT-OFF值（差值小于CUT-OFF值的10％），則該結(jié)果要慎重考慮,，并且相應的樣品需重新實驗,。若樣品的OD值大于或等于CUT-OFF值，則初次判定為陽性,，并需重新實驗,。重復實驗后發(fā)現(xiàn)樣品的OD值還是大于或等于CUT-OFF值，則判為陽性,。若重新實驗后樣品的OD值低于CUT-OFF值則需用其他方法（如免疫組織化學或免疫印跡方法）進行確診,。若重新實驗后實驗結(jié)果還是剛剛低于CUT-OFF值,，則也需用其他方法（如免疫組織化學或免疫印跡方法）進行確診。