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    1．材料

    （1）免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠,。

    （2）1640培養(yǎng)液

    （3）2.5％FCS－1640營養(yǎng)液

    2．操作方法

    （1）拉頸或用CO₂處死小白鼠,。

    （2）將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒,，取出固定于板上,，在無菌條件下取脾。

    （3）把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中,，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球,。

    （4）用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細胞懸液,，用毛細管將懸液移入小試管中,。

    （5）直立小試管3min，使大塊的結締組織下沉,，把細胞懸液移入離心管中,。

    （6）以2.5％FCS—1640充滿離心管，并以400g離心7min～10min（與此同時應開始制備骨髓細胞）,。

    （7）把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮,。

    （8）重復⑹,、⑺步驟,。

    （9）計算細胞，以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查,，活細胞數(shù)應高于80％為合格。

    骨髓瘤細胞能產生并分泌大量的免疫球蛋白,，這樣的瘤細胞融合后,，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞,。

    選擇骨髓瘤細胞的條件：①該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系,，以便兩者的組織相容性抗原一致,；②骨髓瘤細胞必須是靜息狀態(tài)，不產生γ球蛋白或不分泌到細胞外,；③骨髓瘤細胞生長需要一個較高的細胞密度,10⁶個細胞/ml,；④生長速度快，繁殖時間短,。

    目前常用的Balb/c小鼠產生的骨髓瘤細胞株有：①S194/5XXO·BU·1,；②SP2／0—Ag14（簡稱SP₂）；③P₂—X_,？ ­—Ag8·6·5·3（簡稱653）,；④FO

以653zui為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane,，降植烷）誘發(fā)出來的一種漿細胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma,，MOPC）并經過培育形成一株8-氮鳥嘌呤有抵抗力的亞系。

    骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入,，保存于-195℃液氮罐中,，試驗時復蘇、增殖,、傳代即可,。

    由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落,，因此不需要胰酶處理,。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前,，可將培養(yǎng)基內加入15μg/ml 8－氮鳥嘌呤,。取約1×10⁷～6×10⁷對數(shù)生長期（即培養(yǎng)15h～20h）的骨髓瘤細胞，在室溫離心（400g）10min,，沉淀以2.5％FCS—1640液再懸浮并計數(shù),。

    在體外的細胞培養(yǎng)中，單個的或數(shù)量很少的細胞不易生存與繁殖,，必須加入其它活的細胞才能使其生長繁殖,，加入的細胞稱之為飼養(yǎng)細胞（Feeder cell）。在細胞融合和單克隆的選擇過程中,，就是在少量的或單個細胞的基礎上使其生長繁殖成群體,，因此在這一過程中必須使用飼養(yǎng)細胞。許多種類的動物細胞都可以做飼養(yǎng)細胞,，如正常的脾細胞,、胸腺細胞、腹腔滲出細胞等，常選用腹腔滲出細胞,，其中主要是巨噬細胞和淋巴細胞,。應用腹腔滲出細胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細胞，另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細胞和細胞碎片,，為融合細胞的生長造成良好的環(huán)境,。腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠,，如C₅₇鼠,，昆明小白鼠等。

    1．材料

   （1）小鼠（Balb/c或C₅₇小白鼠）若干只,。

   （2）11.6％蔗糖溶液（經10磅30min高壓滅菌）,。

    2．操作方法

   （1）拉頸處死小鼠。

   （2）70％酒精浸泡消毒10min,。

   （3）用手術剪將小鼠腹部剪開一小口,，剝開皮膚，露出腹腔,。

   （4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔,，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管,。

   （5）1 000r／min離心10min,。

   （6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細胞制成懸液,。臺盼藍染色計數(shù)活細胞,，使每毫升含40萬個活細胞。

   （7）以1ml吸管將細胞種入微量培養(yǎng)皿,，每孔0.05ml,，含2萬個細胞，放入CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng),，即可供細胞融合和克隆化之用,。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細胞數(shù)量少，則可以在細胞換液時再加入一些,。