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甲醛洋菜膠體電泳
閱讀：406 發(fā)布時間：2010-12-18甲醛洋菜膠體電泳 （formaldehyde-agarose gel electrophoresis）甲醛是一種常用的RNA 變性劑,。在進行甲醛洋菜膠體電泳分析時，必須先配制含有甲醛的洋菜膠體,，RNA 也必須先以甲醛及formamide 進行變性處理，以確保其二度結構充分被打開,。由于甲醛可能是一種致癌物質，配制膠體及進行電泳分析時都應在抽氣櫥里小心操作,；進行電泳時所使用的緩沖液為MOPS （3-[N-morpholino] propanesulfonic acid）,。此外，含有甲醛的洋菜膠體比較滑溜,，容易破裂,，在移動膠體時應特別留神。由于rRNA 占細胞RNA總量的80~85%,，以ethidium bromide 染色后,，呈現(xiàn)于膠體上的兩個主要RNA色帶應該分別是large 與small rRNAs （真核生物為28S 與18S，原核生物為23S 與16S）,；散布于small rRNA 附近,，呈淡淡smear 的就是mRNAs，這是因為mRNAs 存在量不多,，而且長度不一的緣故,。長度較短的5S rRNA 及tRNA 等則在膠體下方也以特定色帶呈現(xiàn)。
儀器用具：65℃恒溫水槽,；微量離心機,；Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器；UV transilluminator,；防護面罩,；拍立得相機；抽氣櫥
藥品試劑：
自菌體抽取的RNA （I-1, I-2, U-1, and U-2） 與胞外轉錄反應所制備的正意股及反意股RNA （#1, #2, #3, and #4）,。
5×formaldehyde gel running buffer （0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA）
Formaldehyde gel loading buffer （0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol;50% glycerol; 1 mM EDTA）
Ethidium bromide （1 μg/μL in dH2O/DEPC）
dH2O/DEPC
方法步驟：
◆ 注意：
a. 下列實驗主要參照Sambrook and Russell （2001） 的方法,。
b. 進行下列實驗時請務必戴手套。
c. 甲醛與formamide 都放在抽氣櫥內,。
準備一片1.2%甲醛洋菜膠體：
1） 秤取0.48 g agarose置100 mL血清瓶,，加入25 mL dH2O/DEPC。
2） 以微波爐加熱溶解的后,，微微晃動血清瓶使混合均勻,，再移至60℃恒溫水槽靜置5 min。
3） 將裝著agarose 溶液的血清瓶移至抽氣櫥,，加入8 mL 的5× formaldehyde gel running buffer 及7.2 mL 的甲醛,，輕輕搖晃血清瓶以便混合均勻,。
?? 膠體總體積為40 mL，為了避免agarose 溶液因溫度快速下降,，很快便凝固,，應力求動作迅速，但應避免劇烈搖晃,，以免弄出一大堆氣泡,，影響膠體凝結。
4） 盡速于抽氣櫥內把混合液倒入膠體鑄模,，并插入樣本梳 （teeth comb）,。膠體凝固至少需時30 min。
電泳：
1） 要進行電泳時,，把已凝固的洋菜膠體放進電泳槽,，并加入適量1×formadehyde gel running buffer。
2） 以50 V 定電壓預跑5 min,。
3） 依序注入上列8 個RNA 樣本，以50 V 定電壓進行電泳,，待追蹤染劑移動至膠體三分的二處時,，關閉電源，將膠體移至UV transilluminator box,，觀察RNA 色帶的存在情形,，并拍照存證。
?? 注意：這一片膠體往下將用來進行北方轉印實驗,，請小心處置,！