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酶聯(lián)免疫吸附法(EIASA)測定克倫特羅殘留
閱讀:990 發(fā)布時間:2010-10-30(1)試劑和材料 以下所有試劑,,除特別注明外,,均為分析純試劑,;水為符合GB/T6682規(guī)定的二級水。
①鹽酸克倫特羅對照品:含鹽酸克倫特羅不得少于98.5%
②鹽酸
③無水甲醇
④氫氧化鈉
⑤磷酸二氫鉀
⑥磷酸
⑦鹽酸溶液 取鹽酸4.2ml,,加水至1000ml,,即得。
⑧o.5mol/L磷酸二氫鉀溶液 取磷酸二氫鉀68g,,加水800ml溶解并用磷酸調(diào)pH值至3.O,,用水稀釋至1000ml,即得,。
⑨0.05mol幾磷酸二氫鉀溶液 取磷酸二氫鉀6.88,,加水800ml溶解并用磷酸調(diào)pH值至3.0,用水稀釋至1000mi,,即得,。
a.氫氧化鈉溶液 取氫氧化鈉48,加水使溶解成100mi,,即得,。
b.鹽酸克倫特羅對照品儲備液(1mg/mi) 準確稱取28.3mg鹽酸克倫特羅對照晶至25ml量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至25ml,,一20~C以下保存,,有效期1年。
⑩鹽酸克倫特羅對照品工作液(10ttg/mi) 取lmg/mi儲備液o.5ml到50mi量瓶中,,加水至50mi,,2~8~C保存,有效期1個月,。
⑾鹽酸克倫特羅對照溶液(100ng/m1) 取1(ug/m1工作液o.5ml到:50mi量瓶中水至50mi,,2~8~C保存,有效期1個月,。
⑿鹽酸克倫特羅檢測試劑盒(2~8~C冰箱中保存)
⒀固相萃取柱C,,s:100mglml含碳量≥17%
(2)儀器和設備
①酶聯(lián)免疫反應讀數(shù)儀
②分析天平 精度0.00001g
③天平 精度0.01g
④冷凍離心機
⑤50mi具塞離心管
⑥勻漿機
⑦微型振蕩器
⑧回旋振蕩器
⑨微量移液器 單道20uL,50ul,,100uL,;多道50~250uL,
⑩干熱濃縮器
①空氣壓縮機
(3)測定步驟
①試料的制備(尿)
取供試尿lml,,于3000r/min離心l0min,,上清液作為供試試料,直接供酶聯(lián)免疫測定法測定,。
取空白尿lml,,于3000r/min離心l0min,上清液作為空白試料,直接供酶聯(lián)免疫測定法測定,。
取空白尿2ml,,于3000r/min離心lOmin,上清液1.Oml添加lOOug/L的克倫特羅對照溶液20/H,。作為2ug/l空白添加試料,,直接供酶聯(lián)免疫測定法測定。
②試料的制備(肝)
取約lOOg新鮮或冷凍后融化的空白或供試豬肝,用勻漿機以10000r/rain勻漿1-2min,,使均勻呈糊狀,,一20~C以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩?br />取均漿后的供試肝樣,作為供試試料,。
取均漿后的空白肝樣,,作為空白試料。
取均漿后的空白肝樣(1土0.05)e添加lOOng/m1的克倫特羅對照溶液20tzL作為2ng/g空白添加試料,。
a:提?。ǜ危?取(1士o.05)z試料,,置50ml離心管中,;加鹽酸溶液5.Omi,旋渦混勻,,中速振蕩1.5h,;在10—15~C下以4000r/mill以上速度離心15min;上清液移人另一50ml離心管中,,加入氫氧化鈉溶液300gL,,混勻,,振蕩15min,;加o.5mol/l磷酸二氫鉀溶液4.Omi,混勻,,2—8~C放置過夜,;取上述溶液于10~15~C以4000r/111113以上的速度離心15min,上清液備用,。
b.凈化(肝) C,,,固相萃取柱依次用無水甲醇3mi,、o.05mol/L磷酸二氫鉀溶液2mi預洗,,不使柱床干涸;將備用上清液全部過柱,;用o.05mol/L磷酸二氫鉀溶液2ml淋洗,,擠干,棄去所有淋洗液;用無水甲醇2mi洗脫,,流速控制在o.5ml/mm以下,,擠干,收集洗脫液,;于50~60~C下用氮氣或空氣緩緩吹干洗脫液,;殘余物用水1.Omi溶解,以4000r/mill以上的速度離心15rain,,清液作為試樣溶液供酶聯(lián)免疫測定法測定,。
③測定
a.室溫應控制在19~30~C。
b.取在19—30~C放置1—2h的試劑盒,,按每個標準溶液和試樣溶液至少兩孔計算所需酶聯(lián)板條的數(shù)量,,插入框架。每個微孔加入用緩沖溶液100倍稀釋的抗體100~tL,,封口膜封板,,室溫孵育30min。
c倒出孔內(nèi)液體,,將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打,,使孔內(nèi)沒有殘余液體。用多道移液器加水250pL到酶聯(lián)板的微?L內(nèi),,稍后倒出孔內(nèi)液體,,再將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打,如此重復操作洗板3次,。
d.分別吸取標準溶液,、空白試料、空白添加試料和供試試料各20uL,,分別放入不同微孔底中央,,并在每孔內(nèi)加入用緩沖溶液100倍稀釋的酶結(jié)合物100~I。,,在微型振蕩器上混勻,,用封口膜封好,室溫孵育30min,。
e.倒出孔內(nèi)液體,,將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打,使孔內(nèi)沒有殘余液體,,重復洗板3次,。
f.用多道移液器加入用底物緩沖溶液10倍稀釋的底物100uL,室溫避光孵育15min,。
g.用多道移液器每孔加終止液100uL,。
h.在1h內(nèi)將酶聯(lián)板放于酶標儀內(nèi),,于450nm波長處測定吸光度值。
(4)計算 用數(shù)據(jù)分析軟件對結(jié)果進行分析,,繪出標準曲線,,并得出試料中克倫特羅的含量。
(5)靈敏度和回收率
本方法的平均檢測下限為o,,ibg/k8,。
本方法在1Ps/kg添加濃度水平上豬尿回收率范圍為60%一120%,豬肝回收率范圍為40%~120%,。