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SELDI蛋白質(zhì)純化鑒定
閱讀：2913 發(fā)布時(shí)間：2010-8-5
實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)
針對(duì)血清、血漿,、體液,、組織、真菌,、細(xì)菌,、細(xì)胞培養(yǎng)物以及植物等樣本的差異蛋白質(zhì)組研究，以蛋白質(zhì)芯片為載體,，通過對(duì)目標(biāo)疾病樣本組及對(duì)照組之間進(jìn)行鑒定,，以期找到能夠區(qū)分不同組別的差異峰,，并通過對(duì)差異峰進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定找到與目標(biāo)疾病密切關(guān)聯(lián)的基因/蛋白。
一,、目標(biāo)蛋白
1.利用SELDI-TOF-MS蛋白芯片系統(tǒng)尋找出蛋白表達(dá)譜中有意義的差異蛋白,。
2.篩選符合p<0．05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異蛋白或由BPS聚類軟件計(jì)算得出的診斷模型組成蛋白,。
二,、目標(biāo)蛋白的分離純化
1.利用白蛋白/IgG去除試劑盒去除樣本中高豐度蛋白,。
2.利用分子篩K30-100去除樣本中的分子量大于30-100Kda的蛋白。
3.利用與先前SELDI蛋白表達(dá)譜所用的蛋白質(zhì)芯片相一致的納米磁珠吸附包含目標(biāo)蛋白在內(nèi)的一類蛋白（如SELDI表達(dá)譜所用WCX2芯片則選用WCX磁珠）,。
4.蛋白濃縮,，將吸附后的蛋白液體匯集到EP管置于冷凍干燥機(jī)凍干8小時(shí),，即得到蛋白凍干干粉。
5.蛋白定量,，總蛋白量需達(dá)到50-100ug,，入量不夠可繼續(xù)按之前步驟增加樣品用量,。
6.Tricine聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine -SDS-PAGE）,。
三,、膠內(nèi)蛋白質(zhì)原位酶解和質(zhì)譜鑒定
1.選取考馬斯亮藍(lán)染膠上的蛋白條帶,，同時(shí)切下一個(gè)陽性對(duì)照點(diǎn)和陰性對(duì)照點(diǎn)（空白膠）,，用去離子水充分洗滌,。
2.用含50％乙腈的25 mmo1碳酸氫銨溶液脫色3次，然后用乙腈吸干膠中的水分,，膠粒自然揮發(fā)干燥,。
3.經(jīng)二硫蘇糖醇（DTT）還原和碘乙酰胺（IAA）烷基化后,，膠粒用乙腈脫水后自然揮發(fā)干燥；加入用25 mmo}／L碳酸氫銨溶液配成的適量胰蛋白酶溶液于各管中，室溫1小時(shí)后吸出酶溶液,，再加入適量 25 mmol／L碳酸氧銨溶液使膠粒保濕，37℃保溫12 h,。
4.吸出上清，加入5％三氟乙酸,，50％乙腈溶液40℃保溫1 h,，重復(fù)1次,，合并上清,，自然揮發(fā)干燥溶液終體積為5ml,。
5.基質(zhì)選用Ⅱ一氰基一13一羥基肉桂酸，飽和地溶解在30％乙腈,、lO％丙酮和0.1％的三氟乙酸中,，用Bruker公司肽混合物作為外標(biāo)。質(zhì)譜采用Bruker公司BIFLEX型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）,，在延遲解吸和反射模式下進(jìn)行譜圖的采集,。
6.使用搜索引擎（http://www.matrixscience.com） Mascot在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索,，終確定蛋白質(zhì)的相關(guān)信息,。
四,、目標(biāo)蛋白的免疫學(xué)驗(yàn)證
（一）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）驗(yàn)證鑒定出的蛋白質(zhì)
1.樣本處理：室溫血清自然凝固10-20分鐘，3000rpm離心20分鐘,，收集上清。
2.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣,。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。
4.配液：將30被濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
5.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。
6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50ul,空白孔除外,。
7.溫育、洗滌同上,。
8.顯色：每孔先加入顯色劑A50ul,再加入顯色劑B50ul,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘,。
9.終止：每孔加終止液50ul,，終止反應(yīng)。
10.測定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。
（二）免疫沉淀（Immunoprecipitation）和蛋白質(zhì)芯片檢測
1.取同一份血清樣本20ul,分成a、b兩等份,。
2.a份加入目標(biāo)蛋白的ELISA Kit孔中,，并且入40ul樣品稀釋液，溫育30分鐘,。
3.30分鐘后分別在a、b血清樣本中加入PH=4.0的NaAc350ul和390ul,，置振蕩器400-600轉(zhuǎn)/分, 4℃震蕩1小時(shí),。
4.洗脫2次,，芯片加樣并讀取數(shù)據(jù)。