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（一）,、前期做好充足的準(zhǔn)備工作：

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),，提前準(zhǔn)備好要用的平板計(jì)數(shù)瓊脂、平皿,、試管,、稀釋液（生理鹽水）、三角燒瓶等,。

（二）,、樣品接受：

收到樣品后，確認(rèn)樣品包裝是否完好,，并將其保存在2~8℃冰箱中,，然后在能力驗(yàn)證平臺(tái)進(jìn)行確認(rèn)。

（三）,、樣品處理：

按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)操作（一定要仔細(xì)閱讀作業(yè)指導(dǎo)書(shū)）看看是幾個(gè)樣品及實(shí)驗(yàn)記錄要求,。一般實(shí)驗(yàn)室收到的是干粉樣品或者是固體樣品等,。假如收到的是干粉樣品，那么步就要水化,。

樣品水化步驟（建議）：一般能力驗(yàn)證樣品以國(guó)體粉末形式發(fā)放,，以液體（CFU/mL）形式出報(bào)告。樣品水化前一定要認(rèn)真,、仔細(xì)閱讀作業(yè)指導(dǎo)書(shū),，看看用多少稀釋液水化，水化后作為原液還是多大濃度的樣品來(lái)記錄,。

（四）,、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

a、能力驗(yàn)證時(shí)最好在超潔凈臺(tái)或者生物安全柜里操作,，這樣就要把超潔凈臺(tái)或者生物安全柜提前清理,、消毒處理，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境無(wú)菌,。

b,、提前把要用到的平皿、試管,、稀釋液等放到操作臺(tái)上,。

（五）、實(shí)驗(yàn)操作：

a,、稀釋

將樣品從冰箱中取出達(dá)到室溫后開(kāi)啟使用,，在超潔凈臺(tái)或者生物安全柜下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進(jìn)行水化后吸入無(wú)菌瓶或袋中，再用剩余的稀釋液進(jìn)行洗滌并全部轉(zhuǎn)入無(wú)菌瓶或袋中,。（具體公需多少稀釋液要看作業(yè)指導(dǎo)書(shū)說(shuō)明）

洗滌轉(zhuǎn)移時(shí)注意樣品瓶蓋的清洗和無(wú)菌操作,，將全部的水化液進(jìn)行均質(zhì)混勻，一般作為原液立刻進(jìn)行接種,；再取25mL到225mL稀釋液中均質(zhì)混勻,，制成10-1梯度樣品勻液。

用1mL無(wú)菌吸管取1:10的樣液到9mL生理鹽水試管中,，制成1:100的樣液,，以此類(lèi)推。再將幾個(gè)稀釋度的樣液接種到提前做好標(biāo)記的無(wú)菌平皿中,。

注意事項(xiàng)：

a.一般能力驗(yàn)證的樣品添加的菌落濃度都比較高,，檢測(cè)過(guò)程一定要多做幾個(gè)稀釋度,，每個(gè)稀釋度多做幾個(gè)平板平行。

b.梯度稀釋?zhuān)菏顷P(guān)鍵步驟,，必須盡可能地減少誤差（新手建議渦旋混勻,，渦旋時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間離心力等作用下,，微生物細(xì)胞可能死亡）,。

c、傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫,，溫度過(guò)高會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng),，過(guò)低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無(wú)水浴,，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜,。

d、傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一,，從12~20mL不等,，一般以15mL較為適宜，平板過(guò)厚可影響觀察,，太薄又易于干裂,。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物,，應(yīng)將底部棄去,，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察,。

e、傾注過(guò)程力度一定掌握好,，絕不能把瓊脂濺出來(lái),。

f、為使菌落能在平板上均勻分布,，檢液加入平皿時(shí)要盡可能放在中央部位,，然后應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn),，檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過(guò)20min,，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。

g,、瓊脂瓶放水浴鍋前一定要混合均勻,，以防出現(xiàn)平皿不凝固現(xiàn)象；拿出傾注時(shí)要用噴有75%酒精的抹布擦拭干凈,。

h,、冷卻的過(guò)程不要著急，冷卻充分后再倒置放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng),，放置的時(shí)候要盡量避免放到風(fēng)機(jī)口處,，每摞不要超過(guò)6個(gè)平皿。

i,、檢驗(yàn)結(jié)束后所有的稀釋液樣品一定要放到冰箱里0-5℃冷藏,，以備必須再用（一旦第二天發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)做錯(cuò)了，在做一次實(shí)驗(yàn),，死馬當(dāng)活馬醫(yī)）,。