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 pCold-SUMO 原核蛋白表達試劑盒

原核蛋白表達試劑盒簡介       【*  4000/盒     】

         本試劑盒所包含的原核表達載體（pCold-SUMO）是在pCold載體基礎上改造而成（Solarbio ）,，該載體啟動子（CS Promoter）來源于南極嗜冷細菌

，在低溫下（15度）才能啟動蛋白的表達,。低溫下細菌生長緩慢,，使得蛋白合成速度減慢，從而大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率,，提

高了蛋白可溶性表達,，增強了活性蛋白的表達比率。該表達系統(tǒng)所包含的SUMO tag可以極大地提高小分子量蛋白的表達量,，而且進一步提

高了蛋白的可溶表達幾率,。同時，試劑盒配備的SUMO Protease（含6×His標簽）可特異性去除SUMO tag,，從而得到不含任何標簽的重組蛋白,。

原核蛋白表達試劑盒操作方法

       I. 重組質粒構建

1.根據目的基因選擇合適的酶切位點，將pCold-SUMO載體和插入片段分別進行雙酶切

2.酶切完成后 經1％瓊脂糖凝膠電泳,，將線性載體進行凝膠回收（Solarbio, D1200） ,。

3.連接反應（以SolarbioT4連接酶為例）

4.取5 μl連接產物轉入*0 感受態(tài)細胞（Solrbio ,C1200） ，通過測序鑒定重組質粒,。

II. 重組蛋白表達

1. 將重組質粒轉入表達宿主菌ArcticExpress或BL21（DE3）,、BL21（DE3）plys、Origami等感受態(tài)細胞）,。

2. 挑選生長良好的菌落,，接入LB培養(yǎng)基（含40-100ug/ml氨芐青霉素），37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.2-0.6,。

4. 待培養(yǎng)基冷卻至15℃后,，再靜置30min。

5. 加入適量IPTG（0.1-1 mM）,15℃振蕩培養(yǎng)24h,。

6. 4,000 rpm室溫離心15min,，收集細胞。

7. 用重懸液重懸細胞（含PMSF或Protease Inhibitor Cocktail）,，并置于冰上破碎,。

8. 破碎后使用SDS-PAGE膠檢測蛋白的表達及可溶性表達情況。

III. 蛋白純化

1.融合SUOM標簽的重組蛋白含有6×His標簽,，重組蛋白可通過Ni-NTA Resin（Solarbio, C0401）進行純化,。詳細的純化操作步驟請參考Solrbio Ni-NTA

Resin（Solarbio ，C0401）說明書。

2.SUMO標簽分子量為15KD,。融合SUOM標簽的重組蛋白可通過SUMO Protease切割去處SUMO標簽,，SUMO Protease切割位點見圖譜。切割后

SUMO標簽含6×His標簽,、目的蛋白不含有6×His標簽,，所以可通過Ni-NTA Resin（Solarbio, C0401） 將SUMO標簽和未*切割的融合蛋白

與不含SUMO標簽的目的蛋白分離純化。

3.本SUMO Protease蛋白分子量為31KD,并含有6×His標簽可通過Ni-NTA Resin去除,。

注意：對于大部分融合蛋白,，SUMO Protease的理想反應液中的NaCl濃度為150mM。然而,，根據實際情況可在100 mM～300 mM之間調節(jié)NaCl

的濃度以達到佳效果,。若蛋白為熱不穩(wěn)定性，請在4°C孵育較長時間或增加酶的用量,。

（2）. 混勻上述體系后于30°C 孵育,，在1、2,、4,、6小時分別吸出30 μl上述反應液，分別置于EP管中,。

（3）. 向上述EP管中加入6 μl 5XSDS Loading Buffer,，置于-20°C。

（4）. 取30 μl樣品進行SDA-PAGE 分析,。

原核蛋白表達試劑盒