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質(zhì)粒DNA分離和純化：
純化要求
質(zhì)粒DNA中不應(yīng)存在對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性有抑制作用的有機(jī)溶
劑分子或過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì),、多
糖,、脂類、基因組和RNA的污染,。不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)于質(zhì)粒純度的
要求不同,，常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（如酶切,、測(cè)序等）普通純度的質(zhì)粒
即可滿足實(shí)驗(yàn)，而對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),，要求質(zhì)粒的純度較高（如高純度或無
內(nèi)毒素）,。可以選擇不同的質(zhì)粒提取試劑盒以滿足不同的實(shí)驗(yàn)要求,。
純化方法
用硅基質(zhì)材料吸附質(zhì)粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式,，提取的質(zhì)
粒純度高、操作方便快捷,，可選擇的試劑盒有兩種類型,，即普通質(zhì)
粒提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。
質(zhì)粒DNA的洗脫和收集
參見基因組DNA提取
質(zhì)粒的保存
溶解在洗脫液TE中的質(zhì)粒DNA,，也可以貯存在TE緩沖液中（用水溶
解的質(zhì)粒只能短期保存,，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室用的純水呈弱酸性，質(zhì)粒在
酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生磷酸解）,，4℃短期保存或-20℃和-70℃長期保
存,，也可在含有質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物中，加等體積甘油,，于-70℃保
存 ,。
質(zhì)粒鑒定與評(píng)價(jià)：
瓊脂糖電泳檢測(cè)
堿裂解法提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí)，理想狀況是只出現(xiàn)
超螺旋—條帶,，但在質(zhì)粒提取過程中,，由于機(jī)械力、酸堿度,、試劑
等原因,，使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條
帶,，這三條帶電泳遷移率從快到慢,，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中
間體（即沒有復(fù)制*的兩個(gè)質(zhì)粒粘連在—起）,。如果加溶液Ⅱ后過
度振蕩,，會(huì)在遠(yuǎn)離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢,，
是大腸桿菌基因組DNA的片斷,。非常偶然的是，有時(shí)候提取的質(zhì)粒
會(huì)出現(xiàn)4個(gè)以上的條帶,，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度
的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致,。但是，只要質(zhì)粒經(jīng)單酶切鑒定
后,，只有單一條帶,，就證明沒有基因組的污染,。
酶切檢測(cè)
質(zhì)粒提取后，為了進(jìn)—步鑒定質(zhì)粒的正確與否,，就要進(jìn)行酶切鑒
定,，通過與Marker對(duì)比，確定質(zhì)粒的分子量大小,。
用紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)
濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為：OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA,。OD260/
OD280比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD260/OD280比值
若低于1.7說明可能有蛋白污染,。OD260/OD280比值若高于2.0則說明
DNA有可能已降解,。如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子
水,，比值會(huì)偏低,，因?yàn)閜H值和離子濃度會(huì)影響光吸收值，但并不表
示純度低,。