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NADH氧化酶（NADH Oxidase,，NOX）試劑盒

商品貨號：QS1004
英文名稱：NADH Oxidase(NOX) Assay Kit
別名：NADH氧化酶試劑盒 NOX Kit NADH氧化酶（NOX）試劑盒 NADH氧化酶（NOX）測試盒
檢測方法：常量法

測定意義： 

NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD,。該酶不僅參與NAD的再生,，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

測定原理：

NOX能夠?qū)ADH氧化為NAD,，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍(lán)（DCPIP）的還原相偶聯(lián),，藍(lán)色的DCPIP被還原為無色的DCPIP，在600nm下測定藍(lán)色DCPIP的還原速率計(jì)算出NADH氧化酶活性的大小,。

貨號：QS1004                                                      規(guī)格：50管/48樣

NADH氧化酶（NADH oxidase,，NOX）試劑盒說明書

可見分光光度法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD,。該酶不僅參與NAD的再生,，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

測定原理：

NOX能夠?qū)ADH氧化為NAD,，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍(lán)（DCPIP）的還原相偶聯(lián),，藍(lán)色的DCPIP被還原為無色的DCPIP，在600nm下測定藍(lán)色DCPIP的還原速率計(jì)算出NADH氧化酶活性的大小,。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

可見分光光度計(jì),、臺式離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、1mL玻璃比色皿、研缽,、冰,、蒸餾水

試劑的組成和配制：

試劑一：液體50mL×1瓶，-20℃保存,。

試劑二：液體10mL×1瓶,，-20℃保存。

試劑三：液體1mL×1瓶,，-20℃保存,。

試劑四：液體50mL×1瓶，4℃保存,。

試劑五：液體6 mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑六：粉劑×2瓶，-20℃保存,；臨用前每瓶加入5mL蒸餾水,；用不完的試劑分裝后-20℃

        保存，禁止反復(fù)凍融,。

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

• 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
• 將勻漿600g,，4℃離心5min,。
• 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心10min。
• 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做）,。
• 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三,，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10秒,，重復(fù)30次），用于NOX活性測定,。

血清（漿）樣品：直接檢測,。

測定步驟：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至600nm,，蒸餾水調(diào)零,。
2. 樣本測定

（1）試劑四、試劑五和試劑六于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min,。

（2）在1mL石英比色皿中加入40μL樣本,、700μL試劑四、100μL試劑五和160μL試劑六,，混勻,，記錄600nm處20s時吸光值A(chǔ)1和 1min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2,。

NOX活力單位的計(jì)算：

1,、血清（漿）NOX活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位,。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中NOX活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位,。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位,。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位,。

NOX（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL,； V樣：加入樣本體積,，0.04mL；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL,；T：反應(yīng)時間，1 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬。