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NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒

商品貨號：QS1002
英文名稱：NAD-Malate Dehydrogenase（NAD-MDH）Assay Kit
別名：NAD-蘋果酸脫氫酶試劑盒 NAD-MDH Kit NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒 NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）測試盒
檢測方法：常量法

• 產(chǎn)品詳細(xì)介紹
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• 產(chǎn)品說明書

測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸,；相反,，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物,， 連接多條重要的代謝途徑,。因此,，MDH在細(xì)胞多種生理活動中扮演著重要的角色,，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng),、活性氧代謝和抗病性等,。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH,，細(xì)菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細(xì)胞中,，NAD-MDH分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中,。

測定原理：

NAD-MDH催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸,，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。

貨號：QS1002                                           規(guī)格：50管/48樣

NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒說明書

紫外分光光度法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸,；相反,，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物,， 連接多條重要的代謝途徑。因此,，MDH在細(xì)胞多種生理活動中扮演著重要的角色,，包括線粒體的能量代謝,、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等,。根據(jù)不同的輔酶特異性,，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH，細(xì)菌中通常只含有NAD-MDH,，在真核細(xì)胞中，NAD-MDH分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中,。

測定原理：

NAD-MDH催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸,，導(dǎo)致340nm處光吸收下降,。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、1 mL石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一: 提取液60 mL×1瓶,，在4℃保存,；

試劑二: 液體50 mL×1瓶，在4℃保存,；

試劑三: 粉劑×2支,，-20℃保存,；臨用前加入300μL蒸餾水，充分溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑四: 粉劑×2支,，-20℃保存,；臨用前加入300μL蒸餾水,，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

樣本測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W,，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）,；8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）,，進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零,。
2. 將試劑二在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上,。
3. 操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中,，混勻后立即在340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2,。

注意：若A1-A2大于0.5,，需將樣本用提取液稀釋，使A1-A2小于0.5,，可提高檢測靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),。

NAD-MDH活力單位的計(jì)算：

1,、血清（漿）NAD-MDH活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=6430×ΔA

2,、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD-MDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

NAD-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=3.215×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，8×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min,；W：樣本質(zhì)量,，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，2000萬,。