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吖啶橙熒光染色法基本原理：

    吖啶橙（acridine orange,，AO）是一種常用熒光染料,，吖啶橙與原代細胞內的DNA、RNA都有親和力,，但有一定的特異性,，即結合后發(fā)不同顏色的熒光，DNA呈亮綠色,，而RNA呈橘紅色至火紅色,。此法簡便快捷,，既可染活原代細胞又可染固定原代細胞,。用于直接染色觀察活原代細胞或固定染色觀察原代細胞均可。吖啶橙對活原代細胞毒性小,，配成1×10-4-2×10-4可用于直接染色活原代細胞和進行熒光顯微鏡觀察,，但不持久,，用固定染色觀察法效果更好。

 

材料：

1.蓋片單層培養(yǎng)原代細胞,；

2.固定劑：95%乙醇或乙酸/甲醇（現配）,；

3.吖啶橙：用生理鹽水配成1%的干液。使用時再用PBS稀釋成1×10-4-2×10-4mol/L pH4.5-5.0的染色液,；

4.0.1mol/L的CaCl2,；

5.1%乙酸。

 

染色步驟：

1.將蓋片單層培養(yǎng)原代細胞從瓶中取出,，立即用溫Hanks液漂洗3-5s,，以去除培養(yǎng)基中血清；

2.投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15-30min,，用濾紙接觸蓋片邊緣,，蓋片微干；

3.用1%乙酸酸化30s,；

4.用1×10-4-2×10-4的吖啶橙染液染色30s或1min,；

5.用0.1mol/L的CaCl2處理30s-2min；

6.PBS漂洗3次,，每次數秒,；

7.PBS封片，熒光顯微鏡下直接觀察并拍照,；

8.注意事項：觀察中應隨時填加PBS以避免標本干涸,。如用油浸鏡觀察，需再覆以大蓋片蓋在附有原代細胞蓋片上,，保證原代細胞面朝上,，用無熒光性油浸鏡觀察。原代細胞蓋片標本在95%乙醇中能保存數日后仍可觀察,，如退色,，再用AO染色。鏡下觀察,，DNA呈翠綠色,，RNA呈火紅色。 結果：原代細胞核因含DNA呈綠色,，細胞質及核仁因含RNA呈紅色,。