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基因診斷的概念  
一,、基本概念：  
1．人類的絕大多數(shù)疾病都與基因有關(guān),，基因變異引起疾病兩種類型：  
1) 內(nèi)源基因變異：由于先天遺傳和后天內(nèi)外環(huán)境因素的影響，人類的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)的各個(gè)環(huán)節(jié)都可發(fā)生異常,，從而導(dǎo)致疾病,。分基因結(jié)構(gòu)突變和表達(dá)異常。  
2) 外源基因的入侵：各種病原體感染人體后,，其特異的基因被帶入人體并在體內(nèi)增殖引起各種疾病,。基因改變引起各種表型改變，從而引起疾病,，從基因水平探測(cè)分析病因和疾病的發(fā)病機(jī)制,，并采用針對(duì)性的手段矯正疾病是近年基礎(chǔ)和臨床的方向。  
２．基因診斷：利用現(xiàn)代生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法,，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平是否正常,，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。  
二,、基因診斷的特點(diǎn)：  
1．以基因做檢查材料和檢查目標(biāo)針對(duì)性強(qiáng),；  
2．分子雜交選用特定基因序列作探針，故特異性強(qiáng),；  
3．分子雜交和PCR具有放大效應(yīng),，故有較大的靈敏度；  
4．適用性強(qiáng),，診斷范圍廣,。  

基因診斷的常用技術(shù)　  
一、核酸分子雜交：  
核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測(cè)特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法,。其原理是核酸變性和復(fù)性理論,。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙鏈結(jié)構(gòu),。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行,，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測(cè)樣品的不同又被分為DNA印跡雜交（Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）,。  
（一）核酸分子雜交的基本過程：  
①．DNA或RNA的制備：將待測(cè)樣品用一定方法提取DNA或RNA,。  
②．制備探針；  
③．雜交,；  
④．檢測(cè),。  
1．DNA或RNA的制備：將待測(cè)樣品用一定方法提取DNA或RNA。  
2．基因探針的概念：  
① 基因探針（probe）就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列,，它可以包括整個(gè)基因,，也可以僅僅是/基因的一部分；可以是DNA本身,，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA,。  
② 探針的來源：  
DNA探針根據(jù)其來源有3種：一種來自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe）,；另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA,，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNA探針（cDNA probe）,。與基因組探針不同的是,，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列,。此外，還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA的片段,，稱為寡核苷酸探針,。  
③ 探針的制備：  
進(jìn)行分子突變需要大量的探針拷貝，后者一般是通過分子克?。╩olecular cloning）獲得的,。克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個(gè)體,、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn),，應(yīng)先制備基因組文庫,，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不*水解,，得到許多大小不等的隨機(jī)片段,，將這些片段體外重組到運(yùn)載體（噬菌體、質(zhì)粒等）中去,，再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸桿菌,，這時(shí)在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA的片段的克隆噬菌斑，通過原位雜交,，從中可篩出含有目的基因片段的克隆,，然后通過細(xì)胞擴(kuò)增，制備出大量的探針,。  
為了制備cDNA 探針,，首先需分離純化相應(yīng)mRNA，這從含有大量mRNA的組織,、細(xì)胞中比較容易做到,，如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后,，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,，就可以合成與之互補(bǔ)的DNA(即cDNA)，cDNA與待測(cè)基因的編碼區(qū)有*相同的堿基順序,，但內(nèi)含子已在加工過程中切除,。  
寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補(bǔ)的,，長(zhǎng)度可從十幾到幾十個(gè)核苷酸的片段,。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列,，并用化學(xué)方法合成,。  
④ 探針的標(biāo)記：  
  為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交,，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào),，通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基,。但近年來已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體,，熒光素等作為標(biāo)記物的方法,。但都不及同位素敏感。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是保存時(shí)間較長(zhǎng),，而且避免了同位素的污染,。常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法(nick translation)。