| 常見問題 | 可能原因 | 建議解決方案 |
| 未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低 | 大腸桿茵老化 | 請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新茵落進(jìn)行液體培養(yǎng),。 |
| 質(zhì)粒拷貝數(shù)低 | 由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低,，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體,。 | |
| 菌體中無質(zhì)粒 | 有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在,，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如,，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長(zhǎng)期保存不穩(wěn)定,，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接,，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落,。另外,，檢查篩選所用抗生素種類和工作濃度是否正確,。 | |
| 堿裂解不充分 | 使用過多的菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分,，此時(shí)可減少菌體用量或增加溶液P1、P2和P3的用量,。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒,，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用溶液P1、P2和P3,，可能有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量,。 | |
| 溶液使用不當(dāng) | 溶液P2和P3在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁,，應(yīng)置于37℃保溫一段時(shí)間,，直至溶液變?yōu)榍辶梁蟛拍苁褂谩?/div> | |
| 質(zhì)粒未全部溶解（尤其質(zhì)粒較大時(shí)） | 洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間,。 | |
| 洗脫液加入位置不正確 | 洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位,，確保洗脫液能*覆蓋硅膠膜的表面以達(dá)到大洗脫效率。 | |
| 洗脫液不合適 | DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如TE和水,；洗脫液pH值過低會(huì)降低洗脫效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間,，當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)；洗脫時(shí)可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預(yù)熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘,，可提高洗脫效率,。 | |
| 洗脫體積太小 | 洗脫液體積若小于30μl，則不易*浸透硅膠膜,，使洗脫效率降低；洗脫液體積若超過200μl,，則所得的DNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少,。為了得到較高的洗脫效率可以適當(dāng)增大洗脫液體積,。 | |
| 洗脫時(shí)間過短 | 洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有—定影響,，洗脫時(shí)放置2分鐘可達(dá)到較好的效果,。 | |
| 堿裂時(shí)間過長(zhǎng) | 加入溶液P2后裂解時(shí)間不應(yīng)超過5分鐘,。 | |
| 質(zhì)粒純度不高 | 混有蛋白 | 菌體不要過量。經(jīng)溶液P1,、P2和P3處理并離心后溶液應(yīng)為澄清的,，如果還混有微小蛋白懸浮物,，可再次離心去除。 |
| 混有RNA | RNase A處理不*,，請(qǐng)減少菌體用量或加入溶液P3后室溫放置一段時(shí)間,。若溶液P1已保存6個(gè)月以上，請(qǐng)?jiān)谌芤篜1中添加RNaseA,。 | |
| 混有基因組DNA | 加入溶液P2和P3后應(yīng)溫和混勻,，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中,。如果加入溶液P2后過于粘稠,，無法溫和混勻，請(qǐng)減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解,，培養(yǎng)時(shí)間不要超過16小時(shí),。 | |
| 含大量核酸酶的宿主菌 | 宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過程中降解質(zhì)粒DNA,，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性,，好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和*0,。 | |
| 質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式 | 是在質(zhì)粒復(fù)制過程中形成的,，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測(cè)出多條條帶,，單酶切處理后可變成單一條帶,。 | |
| 乙醇?xì)埩?/div> | 漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除柱中殘留液體，并晾干吸附柱,。如果DNA已經(jīng)洗脫出來,，可以用酒精沉淀DNA并風(fēng)干，然后再溶解,。 |
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