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毛細(xì)管區(qū)帶電泳色譜儀分析技術(shù)
毛細(xì)管區(qū)帶電泳色譜儀（CZE）又稱自由溶液區(qū)帶電泳儀，整個(gè)系統(tǒng)采用同一種緩沖液充滿,，以毛細(xì)管為分離通道,，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，利用荷電粒子之間的淌度差異進(jìn)行分離,。
一,、工作原理：
CZE中，粒子的電荷性質(zhì)不同,，電泳方向不同,；粒子的電荷數(shù)量不同,，電泳速度不同；粒子的分子量不同,，電泳速度不同,。在毛細(xì)管中，由于電滲流的存在,，所有粒子都隨電滲流一起向負(fù)極遷移,，電滲流速度約是一般離子電泳速度的5～7倍。各種電性粒子在毛細(xì)管中的遷移速度分別為：
1,、陽離子：vap = veo+ vep,，陽離子電泳方向與電滲流方向一致。
2,、陰離子：vap = veo－vep,，陰離子電泳方向與電滲流方向相反。
3,、中性粒子：vap = veo,，中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流方向一致。
當(dāng)樣品從陽注入毛細(xì)管時(shí),，不同電性的粒子將按不同速度向負(fù)極遷移,，從負(fù)先后流出毛細(xì)管，出峰順序依次是陽離子,、中性粒子和陰離子,。中性粒子無電泳現(xiàn)象，隨電滲流同行,，在陽離子后流出,，但不同結(jié)構(gòu)的中性粒子無法相互分離（電泳圖上是一個(gè)峰）。
電滲流在CZE中起著極其重要的作用：
1,、電滲流具有象HPLC中泵一樣的作用,，推動(dòng)粒子前進(jìn)，加上不同粒子電泳速度和方向的差異,，完成陽離子,、陰離子和中性粒子的分離。
2,、改變電滲流速度的大小和方向,，可改變分離效率和選擇性。這是CZE優(yōu)化分離的重要因素,。
3,、電滲流速度的微小變化會(huì)影響分離結(jié)果的重現(xiàn)性（遷移時(shí)間和峰面積）。
二、特點(diǎn)：
1,、毛細(xì)管不涂敷任何固定液,。
2、結(jié)構(gòu)簡單,，操作方便,。
3、不能分離電中性組分,，因?yàn)殡娭行越M分的淌度差為零,。
4、不能分離質(zhì)荷比相近的組分,，如蛋白質(zhì)－SDS絡(luò)合物,。
三、定性和定量分析：
1,、定性依據(jù)：不同組分的遷移時(shí)間不同,。
2、定量依據(jù)：電泳峰面積或峰高,。
四,、操作條件：
CZE操作條件包括緩沖液、添加劑,、分離電壓和分離溫度等選擇,。
1、緩沖液：
CZE分離過程在緩沖液中進(jìn)行,，緩沖液的選擇直接影響粒子的遷移和分離,。
配制緩沖液時(shí)，必須使用高純蒸餾水和試劑,。使用前要用0.45μm濾膜過濾以除去顆粒等,。
（1）選擇緩沖液應(yīng)遵循的條件：
1）在所選擇的pH范圍內(nèi)有很好的緩沖容量,。
2）在檢測(cè)波長處無吸收或吸收值低。
3）為達(dá)到有效的進(jìn)樣和合適的電泳淌度,，緩沖液pH值至少與被測(cè)組分的等電點(diǎn)相差l個(gè)pH單位,。
4）自身淌度低，即分子大而荷電小,，以減少電流的產(chǎn)生,。
5）只要條件允許，盡可能采用酸性緩沖液,。在低pH值下,，吸附和電滲流都很小，毛細(xì)管涂層的壽命較長。
6）與毛細(xì)管種類匹配,，涂層毛細(xì)管只能在一定pH范圍內(nèi)使用,。
（2）緩沖液pH值的選擇：
1）緩沖液pH值的選擇與樣品性質(zhì)有關(guān),。
?、偻ǔＫ嵝越M分選擇在堿性條件下分離。
?、谕ǔA性組分選擇在酸性條件下分離,。
③蛋白質(zhì),、多肽和氨基酸等兩性物質(zhì)可選酸性（pH = 2）或堿性（pH＞9）分離介質(zhì),。
④糖類樣品通常在pH = 9～11能獲得*分離,。
?、蒴人峄蚱渌鼧悠范嘣趐H = 5～9選擇分離條件。
2）緩沖液pH值的選擇和毛細(xì)管種類有關(guān),。
很多涂層毛細(xì)管只能在一定pH范圍內(nèi)使用,，如聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管只能在pH = 4～9使用，否則涂層易水解失效,。
3）在相同pH下,，不同緩沖液的分離效果可能相差很大。
一般來說,，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑可能是的,。如分離糖類和DNA等分子時(shí)應(yīng)優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖液，因?yàn)榕鹚岣芘c糖羥基形成配位鍵,，增加糖的負(fù)電荷和分離度,。硼酸鹽緩沖液也適用于分離其它含鄰羥基和多羥基的化合物。
4）為了選擇合適的pH值,，需要用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)整介質(zhì)的酸堿性,。
由于多數(shù)緩沖試劑是酸性物質(zhì)如磷酸，所以pH調(diào)節(jié)劑主要是堿類,。常用pH調(diào)節(jié)劑有NaOH,、KOH和Tris等。也可用胺和醇胺等有機(jī)堿如乙醇胺和乙二胺,。如果緩沖試劑為堿類,，可用酸作為調(diào)節(jié)劑，盡量使用弱酸如H3PO4,。
緩沖試劑和調(diào)節(jié)劑的濃度對(duì)改善分離,、抑制吸附和控制焦耳熱等都有影響。一般緩沖試劑的濃度在10～200mmol/L，有時(shí)為了抑制蛋白質(zhì)等的吸附作用,，濃度可高達(dá)500mmol/L（此時(shí)應(yīng)減少分離電壓）,。電導(dǎo)率大的緩沖試劑如磷酸鹽和硼酸鹽等的濃度一般在20mmol/L，電導(dǎo)率小的緩沖試劑如硼酸的濃度可在100mmol/L以上,。
2,、添加劑：
如果緩沖液經(jīng)各種參數(shù)優(yōu)化后仍無法給出良好的分離結(jié)果，可加入添加劑以改善分離,。常用添加劑有：
?。?）無機(jī)電解質(zhì)：NaCl和KCl等。
?。?）有機(jī)溶劑：甲醇和乙腈等,。
（3）非電解質(zhì)高分子：纖維素,、多糖,、聚乙烯醇和Triton X－100等。
?。?）功能性添加劑：手性冠醚和環(huán)糊精等,。
3、分離電壓：
分離電壓是控制柱效,、分離度和遷移時(shí)間的重要因素,。分離電壓與毛細(xì)管內(nèi)徑和長度及緩沖溶液濃度（離子強(qiáng)度）有關(guān)，電壓的極值范圍因系統(tǒng)和組成而異,。
當(dāng)柱長一定時(shí),，在一定電壓范圍內(nèi)，電壓與粒子的遷移速度成線性關(guān)系,。
當(dāng)電壓過高時(shí),，線性關(guān)系偏移，主要是由高電壓引起的焦耳熱造成的,。電壓升高,，產(chǎn)生的焦耳熱增多，在不能有效驅(qū)散所產(chǎn)生焦耳熱的情況下,，柱溫會(huì)顯著升高,，工作電流增大，柱效和分離度降低,。除了采取有效的散熱措施外,，選擇合適的條件,，使在此條件下允許使用較高電壓,，而不致產(chǎn)生過大的電流和過多的焦耳熱，是非常重要的。一般通過作I－V曲線來選擇體系的*分離電壓,。
4,、分離溫度：
毛細(xì)管的溫度不僅影響分離的重視性，而且影響分離效率,。溫度選擇應(yīng)考慮熱效應(yīng),、分析重現(xiàn)性、分離效率和分離介質(zhì)對(duì)溫度的限制等因素,。
溫度應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)確定,。多數(shù)情況下，在20～30℃進(jìn)行電泳能獲得良好的分離效果,。一些糖類樣品需要高于室溫的分離條件,，一些樣品如蛋白質(zhì)等可能需要低于室溫的分離條件。
五,、應(yīng)用：
CZE是CEzui基本,、應(yīng)用zui廣的分離模式。
可分離蛋白質(zhì),、多肽和帶電荷的大小分子,。