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實驗室儀器顯微鏡調(diào)試及其使用方法
1. 顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整
為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明,，在顯微鏡初次安裝和調(diào)試時,，就必須把照明光路系統(tǒng)調(diào)整好，這是正確使用顯微鏡,，并獲得正確,、可*結(jié)果的重要手段和zui基本的要求。此外,，正確掌握照明光路系統(tǒng)的調(diào)整,，是使用顯微鏡過程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟，也是在日常使用過程中不時地檢驗顯微鏡性能的必要手段,。顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整主要有以下4項內(nèi)容：
(1) 照明光源燈室在顯微外的初步調(diào)整
?、?首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素燈泡裝入插座中，安裝時避免手指直接接觸燈泡(可用柔軟的布或紙隔住),，以免燈泡上留有指紋等臟物,，影響燈泡的使用壽命。
?、?把燈室擺在桌面上,，接通電源后，用的螺絲刀調(diào)節(jié)燈的調(diào)焦旋鈕孔(標有“←→”),，使燈絲投影在1-2m外的墻上,，將燈絲成像調(diào)至清晰;然后調(diào)節(jié)燈的高低位置調(diào)節(jié)絲孔(標有“──”)，使燈絲位置高低適當;再調(diào)節(jié)燈的左右位置調(diào)節(jié)螺絲孔(標有“──”),，使燈絲左右位置合適,。
(2) 光源發(fā)光體(燈絲)在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗和校正 目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調(diào)入物鏡的視域范圍內(nèi)，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明,，這是調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的前提條件,。需要的基本工具：對中望遠鏡購置顯微鏡時已配備。
?、?拔掉燈庫內(nèi)的毛玻璃套筒,，把燈室裝回顯微鏡上;
② 選用10×物鏡,，開亮光源程序找樣品并調(diào)焦清晰,，再換用40×物鏡把樣品調(diào)焦清 晰(40×物鏡可以看清燈絲的全貌);
③ 把聚光鏡的孔徑光闌和視場光闌均開到zui大;
?、?拔掉其中一個目鏡,，換上對中望遠鏡，抓住白色部分,，另一手伸縮黑色接目鏡,，就可在視野中看到燈絲像;
⑤ 如燈絲位置不合適,，調(diào)“──”孔,，把燈絲像沿水平方向調(diào)好,，調(diào)“──”孔,，把絲像沿垂直方向調(diào)好，直至將燈絲像調(diào)至剛好充滿物鏡孔徑的光圓像;
?、?調(diào)整完畢后,，將毛玻璃套筒插回原位，拔掉對中望遠鏡,，換回目鏡作下一步調(diào)整,。以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調(diào)整和光源發(fā)光體在顯微鏡內(nèi)位置的校驗，只需在顯微鏡初次安裝調(diào)試及更換燈泡時進行，平時使用顯微鏡時不能隨意亂調(diào)亂動,。萬一調(diào)亂時,，可按上述步驟調(diào)回原狀。
(3) 庫勒照明(Kohler)系統(tǒng)的正確調(diào)整 顯微鏡的正確調(diào)試,，主要工作之一是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整,，而其中的關(guān)鍵是庫勒照明系統(tǒng)的調(diào)整。對于每一位使用顯微鏡的人員,，特別是作顯微照像的人員來說,，應(yīng)該對庫勒照明系統(tǒng)的原理及其調(diào)整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的功能,，拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善,。庫勒照明系統(tǒng)的原理簡單來說就是：光源發(fā)光體上任意一點發(fā)出的光，可以照明顯微鏡的視域范圍,，而光源發(fā)光體上每一點所發(fā)出的光匯集起來,，在顯微鏡的視域中就實現(xiàn)了非常充分而又均勻的照明。調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的目的,，是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明,，防止雜散光對照像系統(tǒng)造成影響或干擾，以免照像時在底片形成灰霧,。高調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的必要部件：視場光闌,、可進行合軸調(diào)整的聚光鏡系統(tǒng)。
?、?選用10×物鏡和10×目鏡;
?、?把聚光鏡前端透鏡擺進光路中，孔徑光闌調(diào)至適中的位置上(不大不小),，再把聚光鏡升到zui頂?shù)奈恢蒙?，聚光鏡轉(zhuǎn)盤調(diào)至明視野“J”位置;
③ 把視場光闌調(diào)至zui小(0.1);
④ 載物臺上放上已封片的生物樣品,，開亮光源,，調(diào)焦清晰;
⑤ 視域中會出現(xiàn)一個局部照明的區(qū)域或亮斑,，這是視場光闌的模糊像,，在其中可以清晰地看到樣品的細節(jié);在它之外是較暗的視域，不一定能把樣品的細節(jié)看得清楚;
?、?把聚光鏡微微地向下調(diào),，使視野中的亮斑逐漸收小，慢慢變成一個清晰的多邊形象,，這便是視場光闌的清晰像;
?、?一般情況下，多邊形象并不在視域*，需要調(diào)整聚光鏡的一對調(diào)中螺絲,，把視場光闌多邊形的像調(diào)至*位置;
?、?逐漸開大視場光闌，使多邊形象成為視域的內(nèi)接多邊形,，進一步核對調(diào)中的狀況,，如對中不夠理想，繼續(xù)微微調(diào)對中螺絲;
?、?將視場光闌稍為再微微開大一些,，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上，至此,，庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整完畢,。庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好以后，整個視域照明均勻,，拍攝的顯微照片明亮清晰,，反差正常。在日后使用過程中應(yīng)特別注意： a. 視場光闌不可任意開大,，但可隨物鏡倍數(shù)的增大而將視場光闌收小,，隨物鏡倍數(shù)的減小而開大; b. 聚光鏡的高低位置不準亂調(diào)，否則會破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng); c. 使用10×以下物鏡時要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外,，使用10×或10×以上物鏡時要將前端透鏡擺入光路中; d. 關(guān)于物鏡倍數(shù)與視場光闌大小配合問題,，在實際使用過程中，作為一般觀察不一定要收小或開大視場光闌,，但作顯微照相時,，為了避免雜散光線對照相系統(tǒng)的干擾，以便能拍攝到較完善的照片,，則應(yīng)在使用每一個倍數(shù)的物鏡時,，把視場光闌調(diào)節(jié)到正好消失于所觀察的視域邊上，這是比較繁復(fù)的工作,，但又非做不可,。較為簡便的方法是把與各個倍數(shù)物鏡相對應(yīng)的視場光闌事先調(diào)整好，并作好記號,，以后使用時根據(jù)記號直接調(diào)至相應(yīng)的位置,。
(4) 孔徑光闌的正確使用 由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率，使用時應(yīng)掌握正確的使用方法,。過去由于對孔徑光闌的認識不足,，往往把它當作是調(diào)節(jié)視野亮度的工具,。雖然調(diào)節(jié)孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度,，但會直接影響成像的反差、對比度及分辨率，在使用過程中應(yīng)盡可能避免,。為了發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用,，以便在觀察時，尤其在作顯微照相時獲得*分辨率,，在每換用一個倍數(shù)的物鏡時,，在樣品調(diào)焦清晰后，需要調(diào)節(jié)孔徑光闌,，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑(物鏡孔徑像)的2/3 ,。調(diào)整方法是用對中望遠鏡對焦于視野中黑色相差環(huán)上，調(diào)節(jié)孔徑光闌,，可以看到一個多邊形的孔徑光闌像,，然后調(diào)到等于物鏡孔徑像的2/3，即介于黑色相差環(huán)外與圓形視域內(nèi)之間,。為方便起見,，可把與各倍數(shù)物鏡相對應(yīng)的孔徑光闌預(yù)先調(diào)整好，并作好標記,，以免每次使用都要重新調(diào)整,。
2. 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術(shù)概要
顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不同顯微鏡檢術(shù)的需要而進行的,。所謂顯微鏡檢術(shù)(microscopy),，概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法,。以下簡述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對應(yīng)的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法,。
(1) 透射光明視野(brightfield) 這是自顯微鏡發(fā)明以來zui傳統(tǒng)、zui普遍的應(yīng)用方法,?；静考?a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察; b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，配有孔徑光闌,。調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后,，即可應(yīng)用明視野法。
適用范圍：所有已染色的組織切片,、血液涂片等,。 注意事項： a. 使用明視野方法觀察時，一定要將庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好; b. 視場光闌不可任意開大,，使用10×,、10×以下和10×以上物鏡時，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實出和擺進光路中; c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野的亮度,，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置,，否則,，會降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng); d. 作顯微照相時，每換用一個倍數(shù)的物鏡,，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌,，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。
(2) 透射光相差法(phase-contrast) 這是現(xiàn)代顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強法,?；静考合嗖钗镧R、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡,、對中望遠鏡,、綠色濾光片。調(diào)整方法： a. 在庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎(chǔ)上,，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰; b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到Ph1對準轉(zhuǎn)盤刻度線位置,，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品; c. 拔掉其中一個目鏡,，換上對中望遠鏡,，并調(diào)焦于視野中的兩個相差環(huán)上(物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)); d. 視野中的兩個相差環(huán)不一定重合，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個調(diào)節(jié)裝置(調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕),，使透光環(huán)作前后左右移動而與黑環(huán)重合; e. 調(diào)整好后,，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中,，即可觀察到樣品的相差像; f. 有20×和40×物鏡觀察時,，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph2位置上，用100物鏡時,，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph3位置上,。適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品,，如各種細胞,、活組織、未染色或不染色的組織切片,、水生生物等,。
(3) 微分干涉相襯法(differential interference-contrast，DIC) 為了克服相差法觀察時樣品細節(jié)像周圍伴隨有光暈,，會掩沒掉本來應(yīng)該看見的細節(jié),，以及樣品或組織切片厚度要求相當薄，原則上下能厚于10?m等局限性,，利用雙光束干涉的原理設(shè)計子微分干涉相襯法,。調(diào)整方法 a. 必須在庫勒明系統(tǒng)已調(diào)好的基礎(chǔ)上才能調(diào)好DIC方法; b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調(diào)焦位置; c. 把起偏器(polarizer)擺入照明光路中,，注意其取向應(yīng)為東—西方向; d. 把聚光鏡轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)到與10×物鏡對應(yīng)使用的位置上,，即DIC 0.3—0.4; e. 在物鏡后方或物鏡轉(zhuǎn)換器上插入10×物鏡使用的DIC插片(DIC slider); f. 把檢偏器(analyser)插入成像光路中,，注意其取向應(yīng)為南—北方; g. 換上待觀察的透明樣品，開亮光源把樣品調(diào)焦清晰; h. 調(diào)節(jié)DIC插片,，使微分干涉相襯的像達到*效果，也就是浮雕效果zui為明顯; i. 同時可調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌,，使反差的效果也達到*; j. 然后再細微調(diào)樣品的細節(jié),，可見樣品中不同層面上的結(jié)構(gòu); k. 如果把補色器(first order red retardation plate)插入，并同時調(diào)節(jié)DIC插片,，可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩,，紅、橙,、黃,、綠、藍,、紫,、粉紅、粉紫及金黃色都具有,。適用范圍：透明或不能染色的組織切片,，厚度可達100?m左右，培養(yǎng)中的活組織和活細胞,、小生生物等,。
(4) 落射光激發(fā)的熒光法(incident-loght fluorescence Epi-FL) 簡稱為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來的一種強有力的反差增強法,。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方,，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察,。該方法較簡便,，效率高，50W的光源強度比透射熒光法的250W還強,。熒光方法是利用波長較短的紫外光,、紫光、藍紫光,、藍光及綠光等去激發(fā)樣品,，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長較長的熒光,。不同物質(zhì)只能吸改特定波長的激發(fā)光,，而釋放的熒光也會有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效,，如某些致病的細菌和螺旋體,，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們*的熒光,，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出*熒光的方法稱為自發(fā)熒光法,。某些物質(zhì)自身不會吸收激發(fā)光,，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料,，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光,，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì),，這稱為間接熒光法,。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、生物學及工業(yè)的特異性研究和鑒別上,。調(diào)整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡,，調(diào)整的方法大致相同。
① 汞燈的安裝 a. 打開包裝,，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上,，安裝時注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側(cè)或右側(cè);
b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上,，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端,，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定; c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中,，鎖緊相應(yīng)的螺絲,，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部的插座上。 d. 詳細的安裝方法請參照有關(guān)說明書,。
?、?汞燈燈室在顯微鏡外的初步調(diào)整： a. 接通汞燈電源，讓汞燈預(yù)熱10-15min; b. 把汞燈燈室擺放在桌面上,，讓汞弧投影到2-3m外的墻上,，劃一條與燈室窗口中心線對地高度一樣的水平線作為參考線; c. 轉(zhuǎn)動燈室調(diào)焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上; d. 分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔,，把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量*近,，但不要重疊在一起。
?、?汞燈汞弧在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗： a. 將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場光闌開到zui大; b. 把熒光濾光片組推到藍光激發(fā)的位置上,，以避免汞燈中的藍光太刺眼; c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙; d. 取下一個物鏡,，使激發(fā)的藍光經(jīng)物鏡轉(zhuǎn)換器的空檔照在白紙上,，白紙上會有一藍色的圓形照明區(qū)域，汞弧的像及其反射像都應(yīng)該出現(xiàn)在這區(qū)域的*部位,，否則,，可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦旋鈕至zui清晰,，然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區(qū)域的*位置,。 e. 調(diào)好之后,，把物鏡裝回去，通過目鏡可見白紙被藍光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光; f. 仔細調(diào)焦,，可看清白紙的纖維;取去白紙,，樣品上的熒光細節(jié)隱約可見而很容易調(diào)焦清晰。
?、?汞燈使用注意事項 目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈,，燈管內(nèi)通有一對鎢電極和液態(tài)汞(室溫下附在管壁上),，未點燃時,，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點燃后,，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強光,，溫度升高，管內(nèi)氣壓迅速升到10個大氣壓,。由于是高氣壓的氣體放電,，必須了解其特性才能安全地使用汞燈。 a. 汞燈接通電源后需要10-15min預(yù)熱時間,，汞才能充分汽化并形成汞弧,，產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光。因此,，觀察前要提早通電; b. 汞燈在使用過程中,，不要隨意開關(guān)汞燈的電源; c. 關(guān)掉汞燈電源后，必須等待15-20min,，待汞燈自燃冷卻后才可再次接通電源,，違反這一操作規(guī)定時，將會造成嚴重后果!由于汞燈內(nèi)的汞蒸氣未*液化,，汞蒸氣內(nèi)阻很小,，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內(nèi)形成強大的電流,，輕則燒斷保險絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈,，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個實驗室,，造成工作人員中毒,，不僅損失了汞燈，還會炸毀燈室內(nèi)的集光-聚光部件,。 d. 汞燈的使用壽命一般只有300h,，使用得當可達600h,，使用壽命與開關(guān)的次數(shù)成反比，應(yīng)集中一批樣呂作2-3h的觀察,。汞燈價格及昂貴,，應(yīng)珍惜使用。 e. 汞燈壽命終結(jié)的標志是點燃困難,，燈管發(fā)黑,。
(5)暗視野法(dark field)
許多透明或半透明的樣品，如細菌,、微生物,、細胞內(nèi)的精細結(jié)構(gòu)及結(jié)晶體的內(nèi)含物等，在明視野顯微鏡中不容易看清楚,，如果采用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度,。以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發(fā)亮的樣品輪廓及其細節(jié)。普遍光學顯微鏡的zui高分辨率為0.2?m,，而暗視野顯微鏡雖然對樣品的細節(jié)構(gòu)造分辨不清楚,，但卻可看到0.004?m以上微細顆粒的存在，即可以看到亞顯微結(jié)構(gòu),，特別適合用來觀察微細的顆粒與細菌等,。
調(diào)整方法：暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡。使用時須先用明視野聚光鏡把庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好,。換上暗視野聚光鏡時,，要把載玻片(樣品)移開，將浸沒油滴在聚光鏡頂部,，再把樣品載玻片擱在物臺上,，浸沒油便充填在兩者之間，這種聚光鏡須與裝有可變光闌的100×油鏡配用,。另一種中倍率干式暗視野聚光鏡可與中倍率的物鏡配用,，這種聚光鏡具有*光擋，照明光只能透過光檔與聚光鏡邊緣之間的透光環(huán)才能進入聚光鏡內(nèi),。對于配備齊全的相差顯微鏡,，與編號為Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環(huán)，可以和 10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果,。