黃體生成素（LH）ELISA試劑盒

 （德國DRG：EIA-1289）

1,、 應用范圍

DRG公司的LH酶聯(lián)免疫吸附試劑盒可用于血清中黃體生成素（LH）的定量檢測。此檢測試劑盒僅供體外診斷用,。

2,、前言說明

在受到下丘腦釋放的黃體生成素釋放激素（LH-RH或者Gn-RH）的影響下，男性和女性的垂體前葉都可以產(chǎn)生LH（黃體生成素）,。在男性中,，LH也叫做促間質(zhì)細胞激素（ICSH），它是一種分子量大約為30000道爾頓的糖蛋白,。它是由兩條不同的氨基酸鏈通過非共價鍵結(jié)合形成的復合物,，一條α鏈，一條β鏈,。α鏈與在人促甲狀腺激素（TSH）,、卵泡刺激素（FSH）和人絨毛膜促性腺激素中找到的α鏈糖蛋白類似。這些激素的不同主要是由于他們β鏈的氨基酸組成不同所造成的,，這也使它們產(chǎn)生了不同的免疫學功能,。男性中LH的分泌是間歇性的，它的基本功能是刺激間質(zhì)細胞（萊迪希細胞）分泌睪酮,。婦女體內(nèi)LH濃度的變化會受到正常月經(jīng)復雜排卵循環(huán)的影響,，這也依賴于沿性腺-下丘腦-垂體軸的一系列激素活動。排卵前孕酮和雌二醇水平的降低啟動了每一個月經(jīng)周期,。隨著激素水平的降低,，下丘腦就增加促性腺激素釋放激素（GnRF）的分泌，它可依次刺激垂體增加FSH的生產(chǎn)和分泌,。增加的FSH水平在卵泡階段可刺激一些卵泡的成熟,，其中的一個卵泡就會成熟為含卵子的卵泡。隨著卵泡的發(fā)育,，雌二醇就開始分泌,，剛開始時很慢，但經(jīng)過12或13天的正常循環(huán)后它就開始迅速增加,。因為垂體的直接刺激和增加的GnRF和FSH水平,，雌二醇的就開始迅速增加，隨之LH就開始釋放了。而這些事件正好組成了排卵前期,。在LH達到zui高水平后,，排卵作用大約會持續(xù)12到18個小時。排卵后就會形成可分泌孕酮和雌激素（這兩種激素是LH的兩個反饋調(diào)節(jié)物）的黃體,。黃體期迅速的緊隨排卵期而來,，黃體期明顯表現(xiàn)為高孕酮水平，雌二醇第二增加,，低LH和FSH水平,。低LH和FSH水平是沿下丘腦-垂體軸雌二醇和孕酮負反饋反應的結(jié)果。受孕后,，胚胎的發(fā)育可產(chǎn)生hCG,，hCG使得黃體繼續(xù)產(chǎn)生孕酮和雌二醇。如果沒有受孕,，黃體就會退化,，相應的孕酮和雌二醇水平就會降低，從而導致了月經(jīng)的形成,。隨著這些激素低激素水平的形成,，下丘腦就又再次開始一月經(jīng)周期患性腺機能退減的病人，其血清LH的濃度會增加,。由于卵巢的發(fā)育不成熟,、原發(fā)性的卵巢功能衰竭、多囊卵巢疾病或絕經(jīng)等原因,，女性體內(nèi)類固醇激素的分泌會減少,，而且在這些情況下，LH的分泌沒有受到調(diào)節(jié),。在男性中,，但睪丸發(fā)育不正常或存在無睪畸形時,，也同樣會失去調(diào)節(jié)激素,。在原發(fā)性睪丸衰竭和克氏綜合征患者中，盡管在雄性激素持續(xù)分泌的情況下LH濃度沒有必要提高,，但我們也可發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)存在著高濃度的LH,。在腎衰竭、肝硬化,、甲狀腺功能亢進和嚴重饑餓的情況下,，LH的濃度也可出現(xiàn)提高。垂體前葉激素的分泌不足也可能導致低LH水平,。正如人們所預測的,，低LH水平可能導致男性和女性不育。雖然LH的低水平在垂體前葉對GnTH刺激反應失效的情況下也會出現(xiàn)，但由于下丘腦GnRH分泌的降低,，LH的水平就有可能降低,。因此低LH水平可表明垂體或下丘腦存在功能障礙，但具體的問題根源必須通過其它實驗確定,。在下丘腦、垂體或性腺功能障礙的鑒別診斷中,，LH濃度的檢測常與FSH一起進行檢測（以為兩者的功能緊密相連）,。此外，激素的水平也可用來確定是否絕經(jīng),、計算排卵時間和監(jiān)測內(nèi)分泌治療效果,。

3、實驗原理

   DRG公司的LH酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）,。反應板上的微檢測孔包被有能結(jié)合LH分子上*抗原位點的單克隆抗體,。一份含有內(nèi)源性LH的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進行孵育，該酶聯(lián)物是一種聯(lián)結(jié)有辣根過氧化物酶的抗LH抗血清,。孵育后,，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。辣根過氧化物酶符合物的總量與樣本中LH的濃度成正相關,。加入底物溶液后,，顯出的顏色強度與病人樣品中LH的濃度成正比。

4,、試劑盒組成:

1）      微量反應板,，1塊 （ 96孔），包被了抗LH的單克隆抗體,。

2）      標準系列:6支,，凍干，1ml,，濃度: 0,10,20,40,100,200mIU/ml

3）      酶聯(lián)物,，1支，11ml,，辣根過氧酶標記的抗LH抗血清,，0.3%的Proclin作為防腐劑。 

4）      底物液,，14ml （TMB）

5）      終止液:1支,，0.5M H₂SO₄, 14ml，避免接觸終止液,，以免刺激或著燒皮膚,。

用于樣品稀釋的零標準品應視需要而定。

5、實驗所需器材（但試劑盒不提供）

1）酶標儀

2）移液器,，25,；50；100μl.

3）蒸餾水

4）吸水紙

5）計時器

6）半對數(shù)紙

6,、儲存條件

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存,，在有效期內(nèi)可以保持活性。不要使用過期試劑,，酶聯(lián)物,、底物溶液、標準品和零標準品必須在2—8℃下貯存,。

   微孔反應板必須在2—8℃下貯存,。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴封起來,。如果包被板的包裝被打開,，其免疫活性在6周內(nèi)穩(wěn)定，但前提是必須將它密封在裝有干燥劑的袋子里,。

7,、試劑準備

實驗開始前，將所有試劑和所需數(shù)目的板條都平衡至室溫,。

標準品：在每支凍干粉的標準品中加入1.0ml蒸餾水重新配置標準品,。注意：配制好的標準品在2-8℃的環(huán)境下可穩(wěn)定存放2個月，要想存放更長的時間則應凍存于-20℃的環(huán)境下,。

8,、樣品

此實驗將用到血清，請不要使用易溶血,、黃疸血和脂血樣品,，注意：含疊氮鈉的樣品不可用于此實驗。

8.1樣品的采集

血清：靜脈穿刺采集全血,，待其凝固,，室溫離心分離血清。未*凝血前請勿離心,，接受了抗凝劑治療的病人可能需要更長的凝血時間,。

8.2樣品儲存

實驗開始前應用蓋子將樣品密封好，2-8℃下可存放48小時,。如果將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下則可將其存放更長時間（只可凍融1次）,。解凍的樣本在實驗之前必須要上下倒置幾次。

8.3樣品的稀釋：

在*次實驗中,，樣本濃度高于zui高標準品的樣品應當在實驗前用零緩沖液進行稀釋,。在計算濃度時,，應當把此稀釋因子考慮進去。例子：

a）按1：10稀釋： 10μL的血清+90μL的零緩沖液（充分混合）,。

b）按1：100稀釋：10ul稀釋好的a）+90μL的零緩沖液（充分混合）,。

9、實驗步驟

所有的標準品,、樣品和質(zhì)控品都必須做雙份檢測以保證它們的檢測條件都一樣,。每次檢測都必須有一條標準曲線。

1）      將所需數(shù)目的板條置于板架上,。

2）      將標準品,、質(zhì)控和血清樣本分別25μl加入到相應的微孔中，每次都得使用新的取樣吸頭,。

3）      加100μl的抗LH酶聯(lián)物于各孔中。

4）      混勻10秒,此步驟中*混勻很重要,。

5）      室溫溫育（22℃）30分鐘,。

6）      棄去孔內(nèi)的反應液。用蒸餾水洗板5次（每孔400ul）,，在吸水紙上把板拍干以除去殘余液體,。注意：洗板步驟是否正確會明顯影響實驗的靈敏度和精密度。

7）      依原先加樣順序,每孔加100μl底物液,。

8）      室溫（22℃）溫育10分鐘,。

9）      按加底物液順序,每孔加50μl終止液于各孔中。

10）  加終止液后10分鐘內(nèi)在450nm波長讀吸光度,。

10,、結(jié)果計算

1）      計算每個標準品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值,。

2）      用吸光度值作為縱坐標（y）,，濃度值作為橫坐標（x），以每個標準品的吸光度值對其相應的濃度值（mIU/ml）進行標繪,，作一條標準曲線,。

3）      用每一樣品的平均吸光度值在標準曲線上確定其相應的濃度。

4）      自動計算方法：說明書上的結(jié)果是用四參數(shù)計算得到的,，其它的歸納方法可能會給出稍微不同的結(jié)果,。

5）      樣品的濃度可直接從標準曲線上讀取。樣品中LH濃度高于zui高標準品的必須進行進一步的稀釋,，任何稀釋了的樣品在計算時都必須將相應的稀釋因子考慮進去,。

11、正常值

強烈建議每個實驗室都確定自己的正常值范圍和不正常值范圍,。

用DRG公司的LH ELISA試劑盒對明顯健康人群進行一研究,，得到如下結(jié)果：

本譯文僅供參考,，詳情請以原文為準。

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