胰島素ELISA試劑盒

（德國DRG：EIA2935）

1,、前言說明

DRG公司的胰島素酶免試劑盒可用于人血清和血漿中（加入了肝素或檸檬酸的血漿）胰島素的定量檢測,。此檢測試劑盒僅供體外診斷用,。

胰島素是調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的主要激素,，它由朗格漢氏小島的β細(xì)胞合成分泌,，并以前胰島素的前體形式存在,，前胰島素可加工形成C肽和胰島素。這兩種激素都以等量形式分泌到門脈循環(huán)中,。成熟的胰島素分子由兩條多肽鏈組成,，A鏈和B鏈（分別21個和30個氨基酸）。這兩條鏈通過鍵內(nèi)二硫鍵而連接到一起,。胰島素的分泌主要受血漿葡萄糖濃度的影響,，這種激素有一系列重要的代謝功能,。它的主要功能是通過葡萄糖的運(yùn)送來控制外周組織中葡萄糖的攝取和利用。胰島素和其它低血糖激素的作用（如抑制肝糖原的異生和糖原分解）可被高血糖激素（胰高血糖素,，腎上腺素,，生長激素和皮質(zhì)醇）的作用中和掉。在胰島素依賴性的糖尿?。?/span>IDDM）和其它疾病例如垂體機(jī)能減退疾病中,胰島素的濃度會明顯降低,。在非胰島素依賴性的糖尿病患者、肥胖患者,、胰島素瘤患者和一些內(nèi)分泌功能紊亂（如庫欣綜合癥和支端肥大癥）患者的體內(nèi),，其胰島素的水平會上升。

2,、實驗原理

DRG公司的胰島素酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶聯(lián)免吸附實驗（ELISA）,反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合胰島素分子上*抗原位點的單克隆抗體,。一份含有內(nèi)源性胰島素的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，該酶聯(lián)物是一種生物素標(biāo)記的抗胰島素抗體,。孵育后,，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。在第二次溫育時,，鏈親和素過氧酶復(fù)合物結(jié)合到生物素化抗胰島素抗體上,，過氧酶復(fù)合物的結(jié)合量與樣品中胰島素的濃度成正比。加入底物液后,，所顯示的顏色強(qiáng)度與病人樣品中胰島素的濃度成正比,。

3、試劑盒成分

1）       微孔板：12×8,，96孔,，包被抗胰島素的單克隆抗體。

2）       零標(biāo)準(zhǔn)品 ：1支,，3ml,，即用，0μIU/ml,。

3）       標(biāo)準(zhǔn)品1－5：5支,，1ml，即用,，6.25;12.5;25;50;100μlU/ml,。

4）       酶聯(lián)物：1支，5ml,，即用，生物素化的鼠單克隆抗體,。

5）       酶復(fù)合物：1支,，7ml,，即用，辣根過氧化物-鏈親和素復(fù)合物,。

6）       TMB底物液：1支 14ml 即用,。

7）       終止液： 1支 14ml 即用 包含0.5M硫酸,請勿接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚,。

8）       洗滌液：1瓶,，30ml，40倍濃縮,，見試劑準(zhǔn)備,。

注意：用樣品稀釋的零標(biāo)準(zhǔn)品視需要而定。

4,、實驗所需材料（但試劑盒不提供）

1）  酶標(biāo)儀

2）  標(biāo)準(zhǔn)移液器

3）  吸水紙

4）  蒸餾水

5,、試劑的儲存與穩(wěn)定性

所有的未開啟的試劑在2－8℃下儲存至保質(zhì)期，不要使用過期的試劑,。所有開啟的試劑應(yīng)在2－8℃下儲存,。一旦打開微孔板的包裝，需將其重新密封,。

6,、樣品的準(zhǔn)備

將所有的試劑和所需要的板條在使用前平衡至室溫。

洗滌液：用1170ml的蒸餾水稀釋30ml濃縮的洗滌液,，zui終得到的容積為1200ml,，稀釋好的洗滌液在室溫下可穩(wěn)定存放兩個星期。

7,、樣品的收集

此ELISA試劑盒可使用血清也可使用（只有肝素或檸檬酸鹽抗凝的血漿）血漿作為樣品,。

不能使用明顯溶血﹑黃疸和脂血的樣品。

血清：靜脈穿刺采集全血,，待其凝血,，在室溫下離心分離血清。

血漿：將全血采集到含有抗凝劑的離心管,，采集后立即離心分離,。

8、樣品的儲存：

樣品蓋好蓋子后,，可在實驗前2-8℃下儲存5天,，要更長時間儲存，應(yīng)在-20℃下凍存,。在開始實驗前應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品,。

9、樣品的稀釋：

在*次實驗中,，要是樣品的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品,，則樣品應(yīng)用按實驗步驟所描述的10倍或100倍稀釋,。在計算濃度時需乘以此稀釋度。

例子：

a）  按1：10稀釋： 10μL的血清+90μL的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分搖勻）,。

b）  按1：100釋?。?/span>10μL按a）稀釋的血清+90μL的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分搖勻）

10、實驗步驟

所有的標(biāo)準(zhǔn)品,、質(zhì)控品和樣品都必須做雙份檢測以確保所有微孔的檢測條件都一樣,。

1）將所需數(shù)目的板條置于板架上。,。

2）用一次性吸嘴將標(biāo)準(zhǔn)品﹑質(zhì)控品和樣品分別25μL加入相應(yīng)的檢測孔中,。

3）每孔加入25μL的酶聯(lián)物。

4）充分混合10秒,，在此步驟中充分混合非常重要,。

5）室溫下溫育30分鐘。

6）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物,，每孔加入400μL的洗滌液洗板三次,，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和度,。

7）每孔加入50μL的酶復(fù)合物,。

8）在室溫下溫育30分鐘。

9）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物,，每孔加入400μL的洗滌液洗板三次,，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。

10）每孔加入50μL的底物液,。

11）在室溫下溫育15分鐘,。

12）每孔加入50μL的終止液終止反應(yīng)。

13）在加終止液后10分鐘內(nèi)于450±10nm處讀取OD值,。

11,、計算結(jié)果：

1）     計算標(biāo)準(zhǔn)品﹑質(zhì)控品和病人樣品的平均吸光度。

2）     以吸光率為Y軸,，濃度為X軸,，按照從標(biāo)準(zhǔn)品中獲得的平均吸光率和其相對應(yīng)的濃度值，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

3）     利用樣品的平均吸光率,，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出其相應(yīng)的濃度值，

4）     自動方法：使用計算機(jī)三次方模式﹑四參數(shù)模式或雙對數(shù)函數(shù)的計算機(jī)程序可得到結(jié)果,。

5）     樣品的濃度可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接獲取,。樣品的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的濃度則需進(jìn)一步稀釋。在計算濃度的時候,，要乘以樣品的稀釋倍數(shù),。

下面是胰島素ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線的典型例子,。

參考值：

建議各實驗室建立自己的正常值與非正常值。

在一明顯正常成年人的研究中,，用DRG公司的胰島素ELISA試劑盒進(jìn)行檢測得到如下數(shù)值：2-25μIU/ml

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn),。

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