DRG瘦素ELISA試劑盒

（德國DRG: EIA-2395）

1、說明

DRG公司的瘦素酶免試劑盒可用于人血清和血漿中瘦素的定量檢測,。此檢測試劑盒僅供體外診斷用,。

2,、實驗原理

   DRG公司的瘦素酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）,。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合瘦素分子上*抗原位點的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性瘦素的病人樣本在包被孔中與特異性兔抗瘦素抗體進行孵育,，之后就會形成一個夾心復合物,。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的物質(zhì),，再加入過氧化物酶標記的抗兔抗體以檢測結(jié)合在包被板上的瘦素的量,。加入底物溶液后，顯出的顏色強度與病人樣品中瘦素的濃度成正比,。

3,、試劑盒成分

1）       包被板，12×8孔,，可拆,，微孔中包被了抗瘦素抗體（單克隆）

2）       標準品（0-5）,，6支 凍干型0.5mL,，濃度：0,2,5,25,50,100ng/ml，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑

3）       質(zhì)控品,， 2支,，200ul，即用,，2個濃度（低與高）,，具體數(shù)值與范圍請見試劑瓶標簽或QC質(zhì)控單。內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。

4）       實驗緩沖液,，1支,，11ml，即用,，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑

5）       抗血清,，1支，11ml,，即用，單克隆瘦素抗血清,，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑,。

6）       酶復合物，1支,，11ml ,，即用，辣根過氧酶標記的抗兔復合物,，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑

7）       TMB底物液,，1支，14ml,，即用

8）       終止液,，1支，14ml,，即用,，內(nèi)含0.5M的H₂SO₄，避免接觸終止液,，以免刺激皮膚或灼燒皮膚,。

9）       洗滌液（40×），1支 30ml

注：零標準品應(yīng)視需要而定,。

4,、實驗所需器材（但試劑盒不提供）

1）       酶標儀 （450±10nm）（如DRG 公司的酶標儀）

2）       取樣槍

3）       吸水紙。

4）       蒸餾水

5,、貯存條件  

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存,，在有效期內(nèi)可以保持活性。不要使用過期試劑,。酶聯(lián)物,、底物溶液、標準品和零標準品必須在2—8℃下貯存,。

   微孔反應(yīng)板必須在2—8℃下貯存,。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴封起來。

6,、樣品采集

1）  血清：靜脈穿刺采集全血,，待其凝血，在室溫下離心分離血清,。未*凝血前請勿離心,，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長的凝血時間。

2）  血漿：將全血采集到含有抗凝劑的離心管,，采集后立即離心分離,。

3）  樣品的儲存：實驗開始前應(yīng)用蓋子將樣品密封好，2-8℃下可存放24個小時,，如實驗之前需將樣品貯存更長的時間,，應(yīng)當將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下，并且只能凍存一次,，不能反復凍存,。解凍的樣本在實驗之前必須要上下倒置幾次。

7,、樣品的稀釋：

在*次實驗中,，要是樣品的濃度高于zui高標準品，則樣品應(yīng)用按實驗步驟所描述用零標準品進行稀釋,，并重新檢測,。并且在計算濃度時需乘上此稀釋因子。

例子：

a）  按1：10稀釋： 10μL的血清+90μL的零標準品（充分搖勻）,。

b）  按1：100釋?。?/span>10μL按a）稀釋的血清+90μL的零標準品（充分搖勻）

8、實驗步驟

所有的標準品,、質(zhì)控品和樣品都必須做雙份檢測以確保所有的檢測條件都一樣,。每一次實驗都有一條標準曲線。

1）將所需數(shù)目的板條置于板架上,。,。

2）用一次性吸嘴將標準品﹑質(zhì)控品和樣品分別15μL加入相應(yīng)的檢測孔中。

3）每孔加入100μL的檢測緩沖液,。

4）充分混合10秒,，在此步驟中充分混合非常重要。

5）室溫下溫育120分鐘,。

6）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物,，每孔用300μL洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體,。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和度,。

7）每孔加入100μL抗血清,。

8）在室溫下溫育30分鐘。

9）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物,，每孔用300μL的洗滌液洗板三次,，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。

10）每孔加入100μL酶聯(lián)物,。

11）在室溫下溫育30分鐘,。

12）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔用300μL的洗滌液洗板三次,，在吸水紙上拍干以除去殘余液體,。

13）每孔加入100μL底物液。

14）室溫溫育15分鐘,。

15）每孔加入50μL終止液以終止酶反應(yīng),。

16）在加終止液后10分鐘內(nèi)于450±10nm處讀取OD值。

9,、結(jié)果計算

1）       計算每個標準品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值,。

2）       用吸光度值作為縱坐標（y）,，濃度值作為橫坐標（x），以每個標準品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值進行標繪,，作一標準曲線,。

3）       用每一樣品的平均吸光度值在標準曲線上確定其相應(yīng)的濃度。

4）       自動計算方法：在IFU上,，它用四參數(shù)曲線已自動計算出結(jié)果,。其它的歸納方法可能會得出稍微不同的結(jié)果。

5）       樣品的濃度可直接從標準曲線上讀取,。樣品中HPL濃度高于zui高標準品的必須用進行進一步的稀釋,。在計算樣品濃度時就應(yīng)當把此稀釋因子考慮進去。

10,、參考值

我們強烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值,。以下結(jié)果是以一定量正常人群的血液樣本為準得出的實驗結(jié)果：

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準,。

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