人細胞毒素相關蛋白A （CagA）檢測試劑盒
（美國DRG進口原裝,，貨號：EIA 4138）
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酶聯(lián)檢測人血清或血漿中抗CagA IgG抗體

實驗原理
此試劑盒基于酶聯(lián)免疫法，采用HRP酶聯(lián)物,；*次孵育中,，樣本中的抗CagA IgG 抗體與包被的CagA 抗原結合,，洗板除去未結合的,，再次孵育,，二抗（過氧化物酶標記的抗人IgG）與CagA-抗原-抗體復合物結合，再次洗板后,，無色的顯色劑（TMB）底物液加入微孔內(nèi),，與過氧化物酶反應生成了有顏色的復合物，加入硫酸終止顏色反應,，酶標儀450nm和405nm處檢測顏色強度,，標準品和樣本中的抗CagA IgG 抗體濃度與顏色強度成正比
 
試劑盒組成
足夠用于96人份的試劑
試劑盒貯存于2-8℃
各試劑有效期見試劑瓶標簽
試劑盒一旦開封，在2-8℃下可保存2個月
 
 

1. 【MTP】包被板,，96孔,，包被有CagA抗原（重組DNA獲得），未用的板條保存于密封袋內(nèi)2-8℃下
2. 【CAL】標準品，6瓶,，1.5ml/瓶,，抗CagA IgG 血清基質，濃度為0;15;30;60;120;240 RU/ml,，即用,，紅色,，*（＜0.1%）作為防腐劑
3. 【CONJ】酶聯(lián)物,，1瓶，14ml,，HRPO標記的小鼠單抗抗人IgG,，TRIS 緩沖液，穩(wěn)定劑,，即用,，粉色，新霉素作為防腐劑
4. 【WASH】洗滌緩沖液（濃縮）,，1瓶,，50ml，PBS-吐溫20 ,，硫柳汞（＜0.05%）作為防腐劑,，使用前，用蒸餾水1:20比例稀釋,；若出現(xiàn)不溶解的晶體,，則需在37℃下溫育數(shù)分鐘；稀釋的洗滌液可在2-8℃下保存30天
5. 【DIL】樣本稀釋液（濃縮,，）1瓶,，20ml，血清基質,，穩(wěn)定劑,，紅色，*（＜0.1%）作為防腐劑,，使用前以稀釋的洗滌液1:20比例稀釋,；稀釋的樣本稀釋液2-8℃下可保存30天
6. 【TMB】顯色劑，2瓶,，15ml,，含檸檬酸-磷酸緩沖液，DMSO和H₂O₂的TMB,，即用
7. 【STOP】封閉液,，1瓶，14ml,，1N的硫酸,，即用
8. 【CPA】蓋板
9. 塑料包裝袋

 
實驗所需材料但試劑盒未提供
 

1. 帶一次性槍頭的可調的,，自動的微量移液器
2. 干燥箱，調節(jié)至37±2℃
3. 用于試劑稀釋的刻度容器
4. 抽吸式泵或自動洗板設備
5. 酶標儀（450nm和405nm）
6. 坐標紙
7. 蒸餾水

 
此實驗還可以用自動酶標儀進行操作
 
樣本采集與準備
試驗可檢測血清或血漿樣本
適量的脂血樣本不會影響結果,，高含量的脂血或溶血樣本可能會影響試驗,，纖維蛋白絲會干擾試驗；確保檢測前樣本是清澈的,，樣本在2-8℃下可保存1周,，想要保存更長時間建議凍存于-20℃，避免反復凍融
使用前：以1:300的比例用先前已稀釋的樣本稀釋液進行樣本稀釋
     （如：10 ul 樣本+ 2990 ul的稀釋液）
 
實驗步驟
試劑和樣本平衡至室溫
使用前來回倒置混勻樣本
 

1. 準備的微孔：空白,，標準品和樣本
2. 加100 ul 的標準品和先前稀釋的樣本于相應的微孔內(nèi)

   注意：標準品不用稀釋
 

1. 空白孔內(nèi)加100 ul 的樣本稀釋液
2. 用試劑盒內(nèi)提供的膠粘紙張蓋住包被板,，37±2℃下孵育60±5 min
3. 350 ul的稀釋的洗滌液，洗板4次,，吸走微孔內(nèi)的所有液體
4. 每孔加100 ul的酶聯(lián)物
5. 用試劑盒內(nèi)提供的膠粘紙張蓋住包被板,，37±2℃下孵育30±2 min
6. 按照步驟5）洗板
7. 每孔加100 ul的顯色劑
8. 37±2℃下孵育15 min，避免直射陽光
9. 每孔加100 ul的封閉液
10. 采用合適的酶標儀在50nm處讀取吸收值,，參考波長620nm（以空白對照孔校零）,，萬一出現(xiàn)了吸收值溢出，則選擇在405nm處讀數(shù),；試驗操作結束15min內(nèi)必須完成讀數(shù)

（若采用的是自動酶標板設備,，依據(jù)相關手冊操作）
 
實驗操作圖

1. 樣本IgG 值小于10 RU/mL，則判定為抗CagA IgG 抗體無反應
2. 樣本IgG 值10 -15 RU/mL,，則判定為弱反應
3. 樣本IgG 值高于15 RU/mL,，則判定為抗CagA IgG 抗體有反應

 
計算示例
以下數(shù)值僅供演示示例，不能用于代替實驗數(shù)值
 
通過標準曲線得到樣本抗CagA IgG 抗體滴度為70 RU/mL
 
驗證標準
結果計算之前,，先確保質控吸收值在以下期望值范圍內(nèi)